分子生物学研究质粒抽提.pptxVIP

一、原理 在碱性溶液中，细菌的线性大分子量染色体双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构破坏而发生变性；而质粒DNA由于分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，在高碱性条件下，虽然变性但仍处于拓朴缠绕状态,两条互补链不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的分子量较大的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白SDS等形成不溶性复合物，可通过离心沉淀被去除。而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，残留的RNA可用RNA酶去除。残留的蛋白质可用酚/氯仿去除,进而得到纯化的质粒DNA。 ;二、材料与试剂 含pET28-gene的E. coli DH5α菌液 （用试剂盒抽提）（用溶液I II III 抽提） 质粒抽提主要溶液： 溶液Ⅰ (P1)：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅱ (P2)：0.2 mol/L NaOH ，1％ SDS。 溶液Ⅲ (P3)：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml, 至100ml 。;１：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解； ２：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度； 3 ：SDS能使蛋白变性并形成不溶性复合物； 4：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAc-冰醋酸能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。 ;一、步骤及原理 从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤： (1)培养细菌使质粒扩增； (2)收集和裂解细胞; (3)分离和纯化质粒DNA。 ;三、操作步骤 (一) 细菌的培养和收集 将含有pET28-gene的DH5α菌种接种在LB 固体培养基中, 37℃培养12-24 小时。 用无菌牙签挑取单菌落接种到50ml LB 液体培养基(含Kan)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。 ;（二）碱法抽提质粒DNA 1、取1.4 ml 培养菌液至1.5ml 离心管中, 10000 rpm 离心2min。弃上清,再吸取1.4 ml 培养菌液于同一离心管， 10000 rpm 离心2min将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽. 2、菌体沉淀重悬浮于150μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡), 3、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容物(千万不要振荡), 室温放置2-5 分钟。 4、加入180μl 预冷的溶液Ⅲ, 盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀, -20℃放置5分钟, 10000 rpm ???心10 分钟。 5、上清液移入干净离心管中,加入等体积的氯仿, 振荡混匀, 10000 rpm 离心5分钟。 6、将水相移入干净离心 管中, 加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000 rpm 离心10 分钟。 7、弃上清,将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀, 4℃下12000g 离心5分钟。 8、吸除上清液,将管倒置于纸巾上使液体流尽, 室温干燥。 9、将沉淀溶于30μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，37 ℃放置1h, 然后储于-20℃冰箱中。 ;（二）TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒DNA 1、柱平衡：向吸附柱CP3加入500ul平衡液BL，10000g离心1min。 2、取1.4 ml 培养菌液至1.5ml 离心管中, 10000g 离心2min，弃上清（重复一次）,将管倒置于纸巾上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于250μl 溶液P1中, 振荡使彻底悬浮。 4、加入250μl溶液P2, 温和颠倒离心管6-8次,混匀内容物。 5、加入350μl 溶液P3,温和颠倒离心管6-8次,使沉淀混匀, 10000g 离心10 min。 6、将上清液转移至吸附柱CP3中（不要吸沉淀）,10000g 离心1min, 弃收集管中的废液。 7、向吸附柱CP3加入700ul漂洗液PW, 10000g 离心1min, 弃废液；再次加入500ul漂洗液PW, 10000g 离心1min, 弃废液。再次离心2min。 8、将吸附柱CP3置于干净离心管, 向膜中央加入30ul洗脱液EB, 室温放置1-2min。 10000g 离心2min,然后储于-20℃冰箱中。;核酸定量 紫外吸收法 比尔-朗伯定律：ODλ = ?c 双链DNA： 1 OD260 ＝ 50 ug/mL 单链DNA和RNA： 1 OD260 ＝ 40 ug/mL 单链寡