火把花根片对EAE大鼠脑和脊髓L-选择素表达影响.docVIP

火把花根片对EAE大鼠脑和脊髓L-选择素表达影响 　　 　　 　　摘 要：目的：探讨火把化根片对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的治疗作用及L-选择素的影响。方法:模型组采用豚鼠髓鞘蛋白匀浆和福氏完全佐剂诱发大鼠急性EAE；治疗组在模型组基础上予以火把化根(600mg·kg-1·d-1)治疗，观察临床表现并评分；HE染色和Loyez氏髓鞘染色观察病理和髓鞘改变；免疫组化技术测定脑和脊髓的L-选择素水平。结果:治疗组未出现临床症状，L-选择素为1.88±0.64，与模型组比较P 　　1.5 取材 所有大鼠于免疫后第16天，10%水合氯醛麻醉后心内取血3mL，离心留取血清-20℃待检，用NS及pH7.4的4%甲醛灌注固定，冠状切取大脑视交叉、小脑皮层、脑干、颈膨大、胸髓和腰膨大等部位组织，石蜡包埋，制成5μm厚脑和脊髓切片各6张，取脑和脊髓各2张进行HE染色和Loyez氏髓鞘染色，各4张用于免疫组织化技术检测L-selectin表达水平。 　　1.6 采用免疫组织化学技术检测L-selectin表达水平 采用SABC方法，实验步骤按试剂盒说明书进行。免疫组化结果的判断:在排除非特异性染色前提下，L-selectin阳性表达以血管内皮细胞表面出现棕黄色颗粒为准。采用Mias(3.0)图象分析系统，对免疫组化染色结果进行半定量分析， 高倍镜(400倍)下在每一张脑及脊髓切片随机各取5个不重复视野，计数每个视野染色阳性的小血管数并相加，5个视野相加即作为每张切片阳性血管数的报告值。 　　1.7 统计学方法 数据以均数±标准差（±s）表示，输入SPSS12.0软件包进行统计学处理。 　　2 结 果 　　2.1 临床表现 正常组、CFA组、LMS组及CRT治疗组均未出现症状，临床评分均为0分。模型组于第13天开始出现症状，发病率为100%，临床症状逐渐加重，先为拖尾、尾巴张力丧失，渐出现共济失调、后肢单肢麻痹，最后进展为双后肢麻痹，无一例死亡，进行评分至第16天止，临床评分为（3.58±1.17）分。 　　2.2 病理改变 正常组、CFA、LMS对照组和CRT治疗组HE染色及Loyez氏髓鞘染色未见异常。模型组HE染色见脑和脊髓白质内小血管周围有大量淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，形成“袖套”样改变，有胶质细胞结节形成；Loyez氏髓鞘染色见髓鞘结构疏松、部分髓鞘脱失。 　　2.3 CRT治疗对L-selectin的影响 见表1。 　　 L-selectin为单链跨膜的受体糖蛋白，属黏附分子选择素家族的成员之一，主要表达于多形核白细胞、单核细胞和某些淋巴细胞亚群表面，可介导多形核白细胞、淋巴细胞起始黏附于活化的内皮细胞，并参与某些亚群淋巴细胞归巢，介导白细胞与内皮细胞间的选择性识别、黏附，在淋巴细胞归巢、白细胞炎性渗出等过程中起重要作用。在局部脑缺血研究中发现\[3\]，L-selectin可在外周血循环中的中性粒细胞表面表达，介导中性粒细胞在微血管 　　内皮细胞上的滚动接触，使中性粒细胞和血管内皮细胞紧密黏附，在中性粒细胞接触血管内皮过程中起亦关键作用，并为其他分子相互作用及中性粒细胞的跨血管迁移提供条件。 　　 正常脑组织缺乏淋巴引流、缺乏二级淋巴器官，并存在血脑屏障（BBB），可以有效防止脑内致炎物质进入外周淋巴结，同时阻止外周循环的免疫细胞进人中枢神经系统（CNS），因而形成独特的“免疫赦免微环境”。对于CNS炎性疾病，自身免疫细胞必须穿过BBB才能到达靶器官-CNS。正常情况下,免疫细胞不能自由出入CNS。L-selectin能介导活化T淋巴细胞归巢，募集特异性粒性白细胞通过BBB进入靶组织CNS之内，通过免疫机制或直接作用导致髓鞘的脱失\[5-7\]。本试验显示：与正常组和对照组相比，模型组大鼠脑和脊髓L-selectin表达明显增高，差异有显著性，进一步表明了L-selectin对EAE的发生起着重要作用。 　　 CRT是治疗自身免疫病的高效低毒药物，它有抗炎作用；抑制病理性免疫反应；抑制Ⅲ、Ⅳ型变态反应；降低毛细血管通透性，减轻组织水肿；不损伤免疫系统器官及防御性免疫反应等。这些都为火把花根片的临床应用提供了理论基础。马希刚等\[8\]研究结果提示火把花根片能抑制大鼠急性肺损伤中肺组织ICAM-1的表达。本实验应用CRT干预EAE发现：治疗组未出现症状，HE染色和Loyez氏髓鞘染色无异常，脑和脊髓L-selectin表达水平较模型组明显降低，差异有显著性。 　　 本研究结果表明：脑和脊髓L-selectin水平增高在大鼠急性EAE中发挥重要作用；CRT能预防大鼠急性EAE发生，CRT的治疗作用机制主要是通过抑制脑和脊髓的L-selectin表达水平，避免了EAE发生