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冻存和复苏的原则：慢冻快融目的是防止在冷冻和复苏过程中形成冰晶伤害细胞。 第六章 细胞培养 第七章 细胞融合和单克隆抗体 一、定义：细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并为一个双核或多核细胞的现象。 可分为自发融合或人工诱导融合 自发融合：在自然界和培养的细胞中均有发现如：有性生殖的过程：精卵融合或肌纤维也是多核细胞，也是自发融合的结果 细胞融合技术：是利用现代科学方法，把不同生物的单细胞融合成一个细胞。这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质。若将之当作一个受精卵来培养，若能长成一个完整的生物个体，就是一个新物种。 细胞融合的方法：将组织消化成分散的单个细胞状态，然后利用化学试剂、病毒或电击刺激诱导细胞相互融合。 1、PEG法 2、病毒法 3、电融合法 第七章 细胞融合和单克隆抗体 单克隆抗体：将免疫动物的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞相互融合，利用产生的杂交瘤细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体制备的原理：简单的说就是骨髓瘤细胞与能产生抗体的B淋巴细胞融合，获得即能无限增殖的又能分泌抗体的杂交瘤细胞。 应用： 1、科学研究上应用 2、用于疾病的诊断 3、用于疾病的治疗 4、用于大分子蛋白的提纯：如免疫亲和层析技术。 第七章 细胞融合和单克隆抗体 单克隆抗体生产的具体过程： 1、免疫动物 2、脾细胞的收集 3、骨髓瘤细胞的培养 4、饲养层细胞的制备 5、细胞融合 6、分装培养 7、抗体检测 8、杂交瘤细胞的克隆 9、冷冻保存 10、抗体的大量制备与生产 第七章 细胞融合和单克隆抗体 杂交瘤细胞的筛选方法：人们采用HAT培养基进行筛选，1964年里特莱弗尔德发明的，其原理是： 亲本细胞的选择: 1) 选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖激酶（HGPRT）缺陷型和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）缺陷型的骨髓瘤细胞做融合亲本 2) 选择不能分泌抗体的突变型的骨髓瘤细胞，以免长生多种混合抗体，影响单抗的产生 3) B淋巴细胞：是经过特定免疫的能产生抗体的动物淋巴细胞，并且免疫动物的种系与骨髓瘤细胞品系一致或有相近的亲缘关系，以保证融合后所产生的杂交瘤细胞的染色体稳定，以稳定的分泌单抗。 4)B淋巴细胞含有TK和HGPRT两种酶的基因 正常细胞在HAT培养液中可利用培养液的胸苷在TK作用下变成胸苷一磷酸（dTMP），随后变成dTTP。但是我们选用的是TK缺陷的骨髓瘤细胞,故不能利用培养液中的胸苷. 因为母本中的骨髓瘤细胞恰好是缺乏这两种酶的，导致无法生存，另一母本淋巴细胞在体外不能长期存活，能存活的只有发生融合的杂交瘤细胞，它融合了B细胞的TK和HGPRT基因，能存活。 第七章 细胞融合和单克隆抗体 单克隆抗体的研究进展： 第一代称为多克隆抗体：抗原刺激机体后，B细胞产生的针对同一抗原的不同抗原决定簇的多种抗体，称为多克隆抗体。如果B细胞同骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞不经过单克隆筛选，其产生的也是多克隆抗体。 第二代称为单克隆抗体 第三代称为基因工程抗体：随着重组技术及细胞工程技术的发展，人们对编码抗体的基因按不同的需要进行加工改造和重新装配，然后在适当的受体细胞中表达为目的的抗体分子，称为基因工程抗体。 第七章 细胞融合和单克隆抗体 基因工程抗体包括： （一）人源化抗体 1、人鼠嵌合抗体；2、改型抗体；3、用转基因小鼠和人源化小鼠生产全人MAb （二）小分子抗体 1、单价小分子抗体； 2、多价小分子抗体 （三）利用抗体库技术制备全人Mab 噬菌体抗体库技术； 第七章 细胞融合和单克隆抗体 第八章 转基因动物 一、定义：动物转基因技术是指以动物的组织或器官的细胞为受体，将特定的目的基因导入这些受体细胞中，并使之与核内DNA发生整合的基因转移手段的总称。由该技术所获得的携带有外源目的基因的动物个体称为转基因动物。 * 细胞工程总复习 绪论 细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。 细胞工程的内容：按照细胞工程操作的对象可以分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。 染色体工程 细胞拆合与重组 细胞培养与单克隆抗体 胚胎移植与试管动物 转基因动物 动物细胞工程 绪论 植物脱毒技术 植物快繁技术 植物细胞培养 原生质体融合 植物转基因技术 植物细胞工程 绪论 染色体工程 一、定义:是人们按照一定的设计、有计划的消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。 二、内容： 1、人工诱导多倍体 2、人工诱导雌雄核发育 3、性别控制 为什么要研究人工诱导多倍体？ 1、绝大多数的多倍体动物，如两栖类动物、鱼类、贝类