第四章 基因工程载体PPT.ppt

?噬菌体和其DNA DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏蛋白基因之间的区段）。 2. ?噬菌体的基因组特点 ? genome(48502bp) ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3. ?DNA的复制模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 滚环复制 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理： 4. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ①在这个非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点 ?噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！ 删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型： ① 插入型载体（insertion vectors)： 如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： 在?基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片段置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 13 1）? EMBL4 ? EMBL4的可置换片段内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片段，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 2）Charon40 Charon40的可置换片段是由DNA短片重复构成，片段之间有Hae I 切点。 在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片段切成小片段，以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 5’ATGACCATGATTACGGATTCA- Me 用N-甲基-N-亚硝基脲 把G甲基化 5’ATGACCATGATTACGGATTCA- 转染E.coli。mG与T配对，复制两次后 5’ATGACCATGATTACGAATTCA- EcoRI切点 用EcoRI切 M13mp1 M13mp2 选择能切开的 线性分子 再环化 M13mp1 ③ 对M13mp2的进一步改进 在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。 M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19 对应有相同MCS的pUC系列载体： pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 成为M13mp系列载体： 12 与pUC18相同 M13mp18的多克隆位点 4. M13系列载体的优点 （1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段 （2） Xgal显色反应，可供直接选择 （3）无包装限制，克隆能力大 （4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链 子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。 MCS + - + - + - 编码链 非编码链 外源DNA 不同的酶切 不同的酶切 插入 M13 vector M13 RF + - + - + - 外源DNA 转染E. coli 成熟的子代M13中 + + ① 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 ② 实际克隆能力小于1500bp。 虽无包装限制，并非无限包装！ 5. M13载体的缺点 6. 噬菌粒载体（phagemid vectors） 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。 MCS 噬菌体ori 质粒ori Ampr lacZ’ lacI 约3000bp（比M13小） ②克隆能力大 能插入10kb的外源DNA。 ③两种复制形式 ①分子量小