缺氧预处理对大鼠钝性心肌挫伤保护作用研究.docVIP

缺氧预处理对大鼠钝性心肌挫伤保护作用研究 　　摘要：目的 观察缺氧预处理(HPC)对大鼠钝性心肌挫伤的保护作用，并进一步探讨其机制。方法 Wistar大鼠建立钝性心脏挫伤模型，并用常规HE染色、免疫组织化学技术(SP法)，结合计算机彩色图像分析技术观察大鼠实验性心脏挫伤及缺氧预处理后Bcl-2、肌钙蛋白T(cTnT)的染色变化。结果 免疫组织化学染色①心脏挫伤2h可见大晟心肌cTnT明显脱失，随着时间延长挫伤组cTnT脱失逐渐加重，与单纯挫伤组相比缺氧预处理组cTnT的脱失显著减轻(P＜0.05)，对照组心肌未见明显脱失；②对照组有少量Bcl-2表达，单纯挫伤组随时间延长Bcl-2表达逐渐增多，与单纯挫伤组相比缺氧预处理组BCl-2表达明显增强(p＜0，05)。结论 Bcl-2的表达说明其参与了心脏挫伤后心肌损伤的形成。缺氧预处理对大鼠钝性心肌挫伤有保护作用，表现为HPC能减轻心肌细胞cTnT的脱失及促进Bcl-2的表达。 　　关键词：缺氧预处理；心肌挫伤；肌钙蛋白T；Bcl-2；大鼠 　　中图分类号：R542.2　R256.2　文献标识码：A　文章编号：1672-1349(2007)12-1210-03 　　 　　心脏钝性挫伤(myocardial contusion，MC)最常见于交通事故，由于胸腔受方向盘直接撞击引起，导致心脏在胸骨和脊椎之间受压。其他原因还有高处坠落、爆炸伤、运动创伤、上腹部挤压等。缺氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)是指预先反复短暂缺氧，可使组织或细胞对后续严重的氧化应激损伤产生抵抗或耐受的一种生物学效应。HPC的方法简便易行，可以广泛应用于临床和实验室研究。实验证明HPC对缺血，再灌注(ischmfia/reperfusion，Z/R)及缺氧／复氧损伤有显著的保护作用，但缺氧预处理是否对心脏挫伤有保护作用尚未见报道。本试验应用健康成年大鼠建立钝性心脏挫伤模型，并用常规HE染色、免疫组织化学技术(SP法)，结合计算机彩色图像分析技术观察大鼠实验性心脏挫伤及缺氧预处理后Bcl-2、肌钙蛋白T(cTnT)的染色变化，探讨HPC是否对钝性心脏挫伤产生保护作用并进一步研究其作用机制。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 材料 自制生物撞击装置及大鼠缺氧预处理装置，MIAS-2000图像分析系统(四川川大智胜软件股份有限公司)，TKR-200C小动物呼吸机(江西特力麻??呼吸设备有限公司)，BL-410生物机能试验系统(成都泰盟科技有限公司)，健康成年Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心)，免疫组化SP试剂盒、cTnT单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司)。 　　　1．2 方法 　　1．2．1 大鼠缺氧预处理模型的制备 参照Sasaki等方法，以挫伤前以氧(10％)和氮(90％)的混合气体进行全身缺氧3h，常氧正常饲养24h复制缺氧预处理模型。 　　1．2．2 大鼠闭合性心脏挫伤模型的建立 预处理组和单纯挫伤组大鼠各24只，大鼠称重后用20％的乌拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉，固定于实验台，放置肢体导连监测心电图，并将心电信号接人计算机触发系统。颈部备皮，纵行切口，分离肌肉，暴露气管，于甲状软骨下约1cm开-T型切口，气管插管与小动物呼吸机相连，在心脏舒张期末，使用自制生物撞击机以相同速率打击大鼠心前区造成心脏挫伤。分别于打击后相应时间段颈椎脱臼处死大鼠，立即取出大鼠心脏在中性甲醛固定。于损伤区和交界区取材，常规脱水，包埋。对照组大鼠只进行气管插管，不进行预处理，不打击。 　　1．2．3 常规HE染色 心脏标本经中性甲醛溶液固定(固定时间24h～36h)，常规脱水包埋，连续切片，常规HE染色，光镜下观察形态学改变。 　　1．1．4 免疫组织化学染色 取各组损伤区心肌组织制作蜡块标本，切成4μm石蜡切片，常规脱蜡至水后，PBS冲洗3min×3次。将切片放人盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，至微波炉内加热使容器内液体温度保持在(92～98)℃(10～15)min进行原修复，取出置室温冷却。PBS冲洗，按免疫组织化学试剂盒说明书SP法分别进行Bd－2，cTnT染色。以厂家提供对照切片做阳性对照，以PBS替代第一抗体作为空白对照。 　　 　　1．3 图像分析 各组切片均应用MIAS--2000图像分析系统对Bcl-2，cTnT免疫组织化学染色的阳性反应物进行定量分析，具体操作为：①每张切片在心脏挫伤区周围随机选取5个高倍视野(放大倍数×100，观察窗面积165203μm2)，测定一定面积内Eel-2阳性目标平均灰度、视场平均灰度和面积密度(阳性目标面积与视场面积的比值)，计算阳性单位(PU)，PU=|G0-GV|/(1-A