张惠展 重组DNA技术与基因工程（3）.pptVIP

基于外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水 的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将 待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基 因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外， 并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形 成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底， 易于辨认。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。 抗菌素抗性基因的鉴定： 抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。 在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。 基于外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子 诱导抗性 抽取重组质粒 再次转化 基于外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 基于外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 DNA结合蛋白编码基因的鉴定： 影印 用聚乙烯薄膜影印裂解平板； 洗涤 杂交 感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定； 80℃烘干固定影印薄膜； 与探针溶液中杂交； 洗涤、干燥、感光。 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板； 聚乙烯膜 探针选用能与 目标蛋白特异 性结合的DNA 片段。 基于外源基因产物检测 蛋白质生物结构鉴定法 放射免疫原位杂交鉴定： 影印 用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印 洗涤 与I125标记的IgG保温 感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定； 与I125标记的IgG保温； 洗涤、干燥、感光 。 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板； 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板； 洗涤 压片 基于外源基因产物检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。 3 重组DNA技术的操作过程 C 转化子的筛选和鉴定（检） B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） A DNA的体外重组（切、接） 转化率 转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质： 不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。 载体的空间构象： 质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于 空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低 两个数量级。 插入片段的大小： 对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 转化率 转化率的影响因素 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则 较高。 转化率 转化率的影响因素 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 转化细胞的扩增 扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时； 原生质体转化后的再生过程； l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作。 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 转化细胞的扩增 C 转化子的筛选和鉴定（检） 基于载体遗传标记检测 基于克隆DNA序列检测 基于外源基因产物检测 3 重组DNA技术的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子 C 转化子的筛选和鉴定（检） 3 重组DNA技术的操作过程 基于载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本原理： RO