张惠展 重组DNA技术与基因工程（6）.pptVIP

E 酵母的表达系统 6 外源基因在酵母中的表达 C 酵母的载体系统 B 酵母的宿主系统 A 酵母作为表达外源基因受体的特征 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 D 酵母的转化系统 G 酵母糖蛋白生产的人源化改造 H 酵母转录机器的基因工程综合改造 huizhzh@ecust.edu.cn* a 型启动子 hmla2-102 MATa a1 Sir3-8TS a 型启动子 受体细胞基因组 重组质粒 a 型启动子 hmla2-102 MATa a1 Sir3-8TS a 型启动子 a2 a1 25℃ 35℃ a - a 型启动子： 酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa 两个等位基因决定。 a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达 编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型 酵母启动子的可控性 温度控制型启动子 超诱导型启动子 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达 GAL10 Promoter 酿酒酵母 的半乳糖 利用酶系 由GAL1 GAL7和 GAL10 基因编码 酵母启动子的可控性 外源基因在酵母中表达的限制因素 外源基因稳态mRNA的浓度 外源基因mRNA的翻译活性 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96% 以上的氨基酸是由25个密码子编码的。 酵母表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酿酒酵母表达系统 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得 有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能 大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 乳酸克鲁维酵母表达系统 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。 酵母表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 巴斯德毕赤酵母表达系统 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。 的高效表达在一定程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 酵母表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母表达系统 酵母表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被 多型汉逊酵母表达系统 克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载 体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 得成功表达。 酵母表达系统的选择 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重 的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其 中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒 还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒 感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其 广泛应用提供了可靠的保证。 利用重组酵母生产乙肝疫苗 F 6 外源基因在酵母中的表达 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 利用重组酵母生产乙肝疫苗 F 6 外源基因在酵母中的表达 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型