张惠展 重组DNA技术与基因工程（5）.pptVIP

大肠杆菌短链烷烃合成途径的构建：葡萄糖为原料 E 产生物燃料的大肠杆菌工程菌构建 汽油是C4-C12短链烷烃和烯烃的混合物。虽然柴油和醇均可用作汽油的替代品，但其燃料性能均不如汽油。因此，基于生物质直接生产与汽油性能接近的短链 汽油 燃料性能 MJ / kg 46.4 燃点温度 柴油 乙醇 42.2 30.0 475℃ 220℃ 75℃ 烷烃意义重大。 大肠杆菌短链烷烃 途径的构建： 葡萄糖为原料 壬 烷 成 分 327.8 mg/L 含 量 十二烷 十三烷 136.5 mg/L 64.8 mg/L 总 量 580.8 mg/L D 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 5 外源基因在大肠杆菌中的表达 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 E 产生物燃料的大肠杆菌工程菌构建 * * * 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如： 转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族 噬菌体 G片段（G-Fragment） 原核细菌 插入顺序（IS） 真核细菌 转座子（Tn、Ty） 高等植物 可移动因子（Ac、Ds） 高等动物 跳跃基因（mobil gene） IS（1 kb） Ty（5 kb） Tn（2 - 20 kb） ACCATGGTT TTGGTACCA 抗药性基因 转位酶基因 识别位点 阻遏基因 IR IR IR IR IS IS 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：转位因子结构 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：整合形式 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：P1噬菌体的Cre-loxp系统 Cre Cre 5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 3 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 loxP 反向重复序列 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。 同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点。 同源序列依赖型的体内重组：基本形式 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源整合 ori 目的基因 同源区域 标记基因 整合位点 染色体DNA ori 目的基因 同源区域 标记基因 交换区域 染色体DNA ori 标记基因 + 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源交换 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。 在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的，两者分别由lon和clp基因编码，其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon-的大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon -）： 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解也有重要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-和 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 htpR基因缺陷的大肠杆菌受体