细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选.doc.docVIP

微生物学实验报告 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 山东大学生命科学学院 2010.6.10 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。 关键词：营养缺陷 紫外诱变 筛选 生长谱测定 大肠杆菌（E.coli） 一、背景与原理 营养缺陷型因丧失合成某些生活必需物质的能力不能在基本培养基上生长，必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。诱变处理必须选择合适的剂量，不同微生物的最适处理剂量不同，须经预备实验确定。物理诱变的相对剂量与三个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间，往往通过处理时间控制诱变剂量。化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度、处理温度和处理时间。一般通过处理时间来控制剂量，在处理前对诱变剂和菌液分别预热，当二者混合后即可计算处理时间，可精确控制处理剂量。 获得的细胞是不是一定是营养缺陷型还是不能够确定的，还必须经过复证的过程来进行确认。具体的方法，最早的是影印接种法（replica plating）。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验，目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。它的具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50～300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。此法虽然简便易于进行，但是主要的问题在于两次影印的力度和深浅不易控制，容易压坏培养基或者压坏菌体，而且整个过程不易于无菌操作。 本次试验中，采用的复证方法是逐个测定法。把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。用生长谱法鉴定。在同一 图：突变型检出和对比（左图为LB培养基，右图为基本培养基【反相】） 通过对比可以看出，在LB培养基上，39、45、58、70、132、136、152、163号没有生长。相应的，在基本培养基多个位置没有菌落生长，其对应的LB培养基上的菌有可能为营养缺陷型。选取相应的菌株进行了复证（编号未列举）。 复证结果 图3.基本板1~24号 图4.基本板25~48号 图5.LB板1~24号 图6. LB板25~48号 进行对比之后发现， ①LB板只有48号未生长。生长不好的有2、23、46号，剩余的菌生长良好。 ②基本板有2、21、22、23、30、34、38、40、41、46、48号未生长。生长不好的有1、3、5、8、9、10、11、18、26、27、28、29、31、32、35、42、43、47。剩余的均为生长良好。 选择的方法是选择在LB上生长但是在基本培养基上不生长的菌株。因此得出可能的诱变菌株为2、21、22、23、30、34、38、40、41、46号； 最终选取了30号作为生长谱鉴定备选菌，因其表现最典型。 生长谱测定结果 图7为本组得到的结果，可以看出，整个培养基除了6区域之外都呈浑浊状，显示整个培养基都已生长细菌。对照组的9区有菌生长。因此实验是失败的。此处我们以岳文伟组的实验结果为例（图8）进行分析。该图中，仅有在4区域中有浑浊的生长斑，而其他地方都没有生长。 图7 生长谱结果，示透明圈 图8 岳文伟组结果，示生长斑 通过对图8观察，可以看出菌落生长的区域为4号区，而氨基酸加入情况如下表： 1 Lys Arg Met Cys Purine Cystine 2 His Arg Thr Glu Asp Pyrimidine 3 Ala Met Thr Hydro-pro Gly Ser 4 Leu Cys Glu Hydro-pro Ile Val