肾小球系膜细胞中硫氧还蛋白1过表达对基质金属蛋白酶9表达影响.docVIP

肾小球系膜细胞中硫氧还蛋白1过表达对基质金属蛋白酶9表达影响 　　摘　要：为进一步探讨硫氧还蛋白1(thioredoxinl，Trxl)过表达对高糖环境下肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶9(Matrix metauoproteinase 9，MMP9)表达的影响，采用RT-PCR和明胶酶谱法检测细胞中MMP-9 mRNA和酶活性的变化，用脂质体介导瞬时转染法转染正义TIxl及反义Trxl，观察高糖环境Trxl过表达对MMP9表达的影响，结果表明，HBZY-l高糖组与正常糖组比较，MMP9 mRNA在12h，24h，48h时表达增加(P＜0.05)，同时酶活性于12h、24h、48h也明显增高(P＜0.01)，转染正义Trxl组细胞，MMP-9 mRNA水平及MMP9酶活性，在高糖组与正常糖组差异无统计学意义(P＞0.05)；但转染反义Trxl组和未转染组细胞的MMP9 mRNA水平及酶活性，高糖组均比正常糖组表达增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示Trxl过表达可抑制高糖环境诱导的肾小球系膜细胞MMP9高表达。 　　关键词：硫氧还蛋白1：基质金属蛋白酶9；肾小球系膜细胞；瞬时转染 　　中图分类号：R587.2　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0361-06 　　 　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并发症之一，其主要病理特点为肾脏系膜区系膜细胞增生，大量细胞外基质堆积。系膜区变宽或结节形成及肾小管肾小球基底膜增厚等，系膜区系膜细胞增生，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)积聚是DN的特征性病理改变，近年关于ECM降解异常的研究已开始受到关注，基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinases。MMPs)是参与降解ECM的蛋白酶家族，其表达异常是ECM降解异常的重要原因，MMP9作为一种重要的降解ECM的基质金属蛋白酶已引起人们广泛关注，已有研究报道，细胞内氧化应激水平可影响MMP9的表达水平，硫氧还蛋白1是细胞内一种重要的抗氧化蛋白，具有多种生物学功能，如抗氧化应激、促生长、抑制凋亡等，而关于细胞内抗氧化蛋白对MMP9水平的影响目前尚属空白，本实验拟观察高糖环境下Trxl过表达对MMP9表达的影响，为DN系膜细胞外基质生成的调控研究奠定理论基础，也为其治疗与预防提供新的思路。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料 　　1．1．1 实验细胞株与质粒 　　大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)购自武汉大学生物保藏???心，人Trxl的重组质粒(PIRESpur03-sense thioredoxin-1，PIRESpur03-anti thioredoxin-1)由美国范德堡大学David P.Carbone教授馈赠。 　　1．1．2　试剂 　　Trizol、RT-PCR试剂盒、LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司： 抗人Trxl多克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体均购自Santa cruz公司：辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL plus购自Amersham公司：DMEM，RPMI-1640购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；胰酶、明胶(gelatine)购自Sigma公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　细胞培养 　　HBZY-1常规培养于10％胎牛血清RPMI-1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度5％C02，每2～3d用0.25％胰酶消化传代。 　　 　　1．2．2　RT-PCR 　　Trizol一步法从细胞中提取mRNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA质量，紫外分光光度计测定总mRNA的浓度及纯度，取1μg总mRNA经RT-PCR试剂盒逆转录得到相应的cDNA，取上述逆转录cDNA作模板进行PCR扩增(引物序列见表1)，扩增条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后于72℃延伸10min，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像系统进行半定量分析。 　　 　　1．2．3　明胶酶谱分析法 　　取含10μg蛋白的细胞上清与不含点，巯基乙醇的蛋白上样缓冲液(0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝)混匀，在含0.1％明胶的10％SDS中分离，以洗胶缓冲；液(2.5％ Triton X-100，5mmol/L CaCl2，1μmol/LZnCl2，50mmol/L Tris-HCl pH 7.4)洗胶1h，后置于反