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标准曲线→定量 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。 病情评估和预后判断 通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。 抗病毒药物疗效的观察、指导 对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。 遗传疾病的早期诊断 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。 双位点双色检测 肿瘤的诊断 荧光PCR的作用： 可对原癌基因的突变和易位等作出检测。 可对原癌基因的mRNA进行定量分析。 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。 探索癌变发生机理的研究提供参考。 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。 荧光PCR在血液筛查中的应用 NAT(Nucleic Acid Amplification Testing) NAT应用于血液筛查的意义 血液筛查现状 筛查方法：免疫学 输血危险性来源： 窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误 NAT可显著缩短窗口期，提高输血安全性 HBV：缩短6-15天 HCV：缩短41-60天 HIV：缩短10-15天 成本分析 前提： 试剂盒灵敏度（＜500 copies/ml) 24 minipool（矩阵法筛选） 阳性检出率=1/10000 以10000 donars 为例： 试剂用量:473 每份筛查成本=473*每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂费用 1996年，NAT开始应用于献血源的筛查。但由于费用和工作量的问题，NAT应用于个体献血员的筛查实行似乎比较困难。到1997年，欧洲血制品的制造商们开始考虑采用“minipool”的方法，这样可以大大减少工作量和原料用量。 “Pool”的规格取决于所用NAT试剂的检测限度。 1999年1月，欧盟的CPMP提出血浆的 pool样品须进行HCV-RNA的NAT检测，检测限度应达到100 IU/ml( 270 geq/ml)；同年7月1日，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000 IU/ml。 目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000 copies/ml。 举例： HCV 3/6500 Farbe siehe vorne. 2. Spalte Medium Temperature 3. Spalte mit High Temperature. Temperatur visualisieren. Legende: Factor V: 突变检测原理 锚探针 突变探针 突变探针Tm值较锚探针低5℃ 不完全配对 完全配对 突变检测原理 不完全配对 完全配对 温度 低 中 高 Factor V 点突变检测 Forward Primer Reverse Primer DNA CGC CGC LC Red 640 LC Red 705 扩增子 Hybprobe Pair 1 Hybprobe Pair 2 双点突变的检测原理 Without ccc With ccc Mut 1 + Mut 2 WT1 + WT2 Het 1 + Het 2 H20 F2 F3 母婴传播的监控 荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。 急性感染时期HIV的标志物 急性感染时期HCV的标志物 急性感染时期HBV的标志物 病毒颗粒 DNA RNA FQ-PCR RT-FQ PCR 裂解 荧光信号检测 核酸纯化系统 多通道荧光PCR自动检测系统 荧光PCR检测流程 自动加样 多样本混合（Mini pool） 规格：16-96donations “Po