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土壤农杆菌在植物基因工程中应用 　　摘要土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法，农杆菌的Ti质粒包括了复制原点、vir基因、冠瘿碱代谢基因和T－DNA区域。在土壤农杆菌的T－DNA的转移过程中起关键作用的物质和结构是：乙酰丁香酮、T－DNA的右边界、vir基因的诱导表达。 　　关键词土壤农杆茵　T－DNA vir基因　基因工程　克隆载体　乙酰丁香酮 　　中图分类号Q－49　文献标识码E 　　土壤农杆菌是一种植物病原菌，属根瘤菌科，为革兰氏阴性菌，它通过根部伤口侵入植物体，刺激植物在被侵入部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。患病植株生长缓慢，严重时植株死亡。冠瘿瘤的形成是由于土壤农杆菌的Ti质粒上的一段DNA，转入植物细胞后，整合进植物的染色体上，进而干扰被侵染植物的正常生长，这段DNA被称为T－DNA。这种具有天然转基因功能的质粒，被改造后，可以用作基因转移的载体，实现目的基因导入到植物细胞中。 　　1　土壤农杆菌的Ti质粒 　　土壤农杆菌的质粒大小为200－250 kb，包含有四个区域：复制原点、vir基因、冠瘿碱代谢基因和T－DNA区域，如图1所示。 　　1.1　T－DNA区域 　　T－DNA区域包含有一个生长素基因、细胞分裂素基因和冠瘿碱合成基因；这些基因都只有在T－DNA插入植物基因组后才能激活表达，其中生长素基因和细胞分裂素基因可以催化生长素和细胞分裂素的合成，调节植物细胞的生长和分裂，它们的过度表达会引起被侵染部位的植物组织过度生长，形成冠瘿瘤。冠瘿碱合成基因的表达可以在植物冠瘿瘤内催化冠瘿碱合成，冠瘿碱可以为土壤农杆菌的生长繁殖提供碳源和氮源。 　　T－DNA的两端分别有左边界和右边界的序列，右边界的序列包含一个25 kb的重复序列，右边界的完整能保证T－DNA区域中任何基因都能完整地整合到植物基因组中，缺失实验表明，左边界的序列不参与整合过程。 　　1.2　vir基因 　　vir基因位于T－DNA以外的一个35 kb的区域内，已发现有编码基因22－24个，这些基因都编码与T－DNA转移有关的蛋白质；vir基因的表达受植物酚类物质的诱导，其中乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮的诱导作用最强。vir区存在8个操纵子，分别为virA～VirH，一股情况下，除virA和virG外，其他vir基因都处于关闭状态。 　　1.3　冠瘿碱代谢基因 　　冠瘿碱代谢基因的表达能使土壤农杆菌利用冠瘿碱作为碳源和氮源。有证据表明，大部分的其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱作为碳源。因此，土壤农杆菌以其独特的方式来操纵植物细胞，使之成为仅为自己使用的含碳化合物的生产基地。 　　1.4　复制原点 　　与Ti质粒的自我复制有关。 　　2　土壤农杆菌T－DNA转移的分子机制 　　农杆菌T－DNA的转移过程大致分为以下几个步骤。 　　2.1　趋化与附着 　　受伤的植物组织分泌一些酚类、糖类、氨基酸类等趋化性物质吸引农杆菌向受伤部位集中，其中乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮是非常重要的诱导物。 　　2.2　viI基因的诱导表达 　　在Ti质粒的vir区，除virA和virG基因以外，其他基因在没有诱导物存在的情况下都处于关闭状态；virA基因表达的是农杆菌细胞膜上的一种跨膜蛋白(vir蛋白)，而virG基因表达的是胞质蛋白；当virA蛋白接受诱导物(乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮)的作用后，发生磷酸化，使virA蛋白被诱导活化，活化后的virA蛋白又将磷酸基团转移给胞质中的virG蛋白，使virG蛋白被活化；活化的VirG蛋白，通过结合到每个Vir基因上游12 bp序列的Vir盒上，来诱导Vir区各基因的表达。Vir基因表达的蛋白质对T－DNA的剪切、转移和整合有重要作用，其中的virD蛋白与T－DNA的剪切有关，virB蛋白定位在细胞膜上，是T－DNA的转移通道。 　　2.3　T－DNA的剪切和转运 　　在virDl和virD2蛋白的作用下，以质粒的T－DNA为模板，合成一条单链的T－DNA，单链T－DNA在其5’端结合上virD2蛋白，形成T链复合体；该复合体在VirD4蛋白的协助下，通过virB蛋白形成的跨膜通道，进入植物细胞；而VirE2蛋白则在VirEl蛋白的协助下，通过同一运输通道运出，两者在植物细胞质中结合成复合物。 　　2.4　T－DNA在植物细胞内的整合与表达 　　T链复合体在进入植物细胞质后，virD2蛋白可以引导复合体运向核孔，并在virD2和VirE2的共同作用下穿过核孔进入植物细胞核内，某些寄主植物的蛋白质也参与了此过程，T－DNA整合进植物染色体的机制还不太清楚，但整合的部位是随机的。整合后的T－DNA在植物细胞内表达生长素和细胞分裂素，干扰植物的生长，同时还表达冠瘿碱的合成，