ikvav审审pa联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究-experimental study on ik vav trial pa combined with neural stem cell transplantation in treating spinal cord injury in rats.docx

论文独创性说明 本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定， （选择“同意/不同意”）以下事项： 1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文； 2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》或其他 同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 前言随着现代交通业、建筑业的发展，脊髓损伤（ spinal cord injury,SCI）的发生率逐 年上升的趋势显著。据报道，脊髓损伤在我国的年发生率约为 60/100 万。目前脊髓 损伤的治疗仍是医学的一大难题, 脊髓损伤的实验研究也是医学研究的热点，诸多实 验研究都把焦点聚集在脊髓损伤上，目的是探索新的治疗方法，以期能为脊髓损伤 后神经功能的恢复提供一种行之有效的办法。神经干细胞（neural stem cell,NSC）是一类存在于中枢神经系统内具有多向分化 能力的细胞，能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞[1，2]。神经干细胞移植 被认为在脊髓损伤修复方面有着良好的应用前景，国内外众多文献报道大鼠脊髓损 伤后用不同的移植方法；不同时间点给予神经干细胞移植，大鼠的后肢功能都有不 同程度的改善[3-6]，但是不能达到我们预想的结果。不少学者试图通过神经干细胞联 合其他类型细胞或相关外源性神经刺激因子共移植来改善其分化、增殖及迁移能力 [7-9]，以望神经功能得到更多的恢复。但研究结果表明以上努力不仅不能持续有效地 改善和维持神经干细胞的存活、定向分化和增殖能力，也无法克服脊髓损伤后组织 囊变和胶质瘢痕对神经通路重建的屏障作用。究其原因是由于移植的神经干细胞主 要分化为胶质细胞形成瘢痕，而极少向神经元分化；而由胶质细胞形成的胶质瘢痕 及其产生的抑制性的化学分子阻碍了轴突再生[10]。因此，探索一种能促进神经干细 胞存活、增殖、定向分化为神经元、有效抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成并能够使 轴突穿越其屏障的治疗方法对脊髓损伤后症状的改善具有极其重要的意义。近些年，随着组织工程学的发展，纳米技术被用于很多领域中，都得到了不同 程度的良好效果。纳米技术也被用于医学研究中，也取得了一些进步。异亮氨酸-赖 氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）是细胞外基质成分层粘连蛋白 a1 链中所包含 的核心功能片段[11-13],具有良好的生物学活性，并且能促进神经干细胞的增殖、分化， 且利于血管发生[14、15]及抑制胶质细胞分化和黏附[11、14]。异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙 氨酸-缬氨酸多肽两亲性分子 (IKVAV-PA)在特定因子触发下，可自组装成凝胶支架 材料[16-20]。据文献报道，IKVAV 两亲性多肽及其自组装的纳米纤维凝胶支架具有促 进神经干细胞粘附、增殖及分化的作用，而纳米纤维凝胶作为一种微观载体，具备 许多特殊的生物学功能，能为细胞的生存、生长提供了良好的三维环境，其包含的 活性片断密度约增大 1000 倍，有利于与细胞的接触和作用[21]，从而促进神经干细胞 的增殖与定向分化。Tysseling-Mattiace 等[22-26]通过实验证实 IKVAV 两亲性多肽溶液 注射组星形胶质细胞显著减少的同时诱导少突胶质细胞增加并且 IKVAV 两亲性多肽 明显促进神经干细胞的增殖。2007 年 Stupp 等报告在重度脊髓损伤小鼠模型的脊髓损伤局部注射含有生物活性的纳米纤维(含层粘连蛋白和神经干细胞) 6 周后,小鼠恢复行走功能。说明 IKVAV 两亲性多肽溶液及其自组装纳米纤维凝胶与神经干细胞共 移植治疗脊髓损伤有良好前景。本实验是在体外培养神经干细胞，并用免疫荧光学方法对其检测，将含 20mg/L IKVAV 两亲性多肽的神经干细胞培养液与正常培养液对比神经干细胞增殖的情况， 并将神经干细胞与 IKVAV 两亲性多肽共培养后移植于大鼠脊髓损伤模型中，观察在 体内 IKVAV 两亲性多肽对神经干细胞分化情况的影响，并观察其对脊髓损伤大鼠运 动功能恢复的作用。内容与方法1 材料1.1 仪器与设备纤维器械；玻璃培养皿；组织剪；注射器；大小针头；酒精灯；小玻璃瓶；250 毫升的玻璃瓶；5000 毫升