icp4促进mir101表达及mir101调节hsv1复制机制的研究-study on the mechanism of icp 4 promoting mir 101 expression and mir 101 regulating hs v1 replication.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于必威体育官网网址，在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址。（请在相对应的方框内打“√” ）学位论文作者签名：日期：年月日 导师签名 ：日期：年月日中文摘要【目的】microRNAs(miRNAs)是一种内源性 18～26 nt 的单链非编码小分子 RNA，在动植物体内通过靶定编码基因 mRNA 3’UTR 区域直接进行转录后调控 从而发挥其基因表达调控功能。已有研究表明宿主细胞 miRNAs 参与了病毒感 染后的抗病毒免答效应，另一方面病毒感染还可引起宿主细胞内 miRNAs 的表 达升高或降低，宿主细胞 miRNAs 与病毒感染之间存在着密切的相关性。本项 目前期实验结果表明 HSV-1 感染 HeLa 细胞后 miR-101 表达水平显著升高，并 且初步确定 miR-101 通过直接靶定并下调 COX2(Cyclooxygenase 2)和 GRSF1 (G-rich RNA sequence binding factor 1)可能对 HSV-1 的复制产生影响。成熟的 miR-101 有两个前体，为 pre-miR-101-1 和 pre-miR-101-2，分别位于 1 号和 9 号 染色体上，本实验室前期工作证明 HSV-1 感染后 miR-101 的表达水平升高，以 pre-miR-101-2 来源为主。因此本文拟从 HSV-1 诱导 hsa-miR-101-2 表达升高的 现象出发，深入研究 HSV-1 感染后宿主细胞 hsa-miR-101-2 显著升高的具体机制， 以及 miR-101 对 HSV-1 复制的具体调控作用机制，深入阐明宿主细胞 miRNA 与 HSV-1 之间的相互作用关系。【方法】本文主要从 HSV-1 感染后宿主细胞 miR-101 显著升高的具体机制，以 及 miR-101 对 HSV-1 复制的具体调控作用机制两方面进行：1. 首先通过双荧光素酶报告系统实验确定 HSV-1 对 hsa-miR-101-2 启动子的具 体作用方式，确定导致 hsa-miR-101-2 启动子活性变化的 HSV-1 编码的作用 因子。然后通过 qRT-PCR 实验检测该作用因子对 hsa-miR-101-2 及其宿主基 因表达水平的影响，进一步确定该作用因子对 hsa-miR-101-2 的具体调控方 式。最后通过染色质免疫共沉淀实验，凝胶电泳迁移实验确定作用因子是否 作为转录因子与 hsa-miR-101-2 启动子发生直接或间接的相互作用。2. 首先通过病毒滴定，免疫荧光，western blot 等实验进一步确定 miR-101 的直 接靶基因 COX2 和 GRSF1 对 HSV-1 复制的具体作用。然后通过 qRT-PCR 确 定 COX2 对干扰素表达水平的影响；并通过 western blot, RNA 免疫共沉淀及 凝胶电泳迁移实验确定 GRSF1 促进 HSV-1 衣壳蛋白表达的具体作用方式， 最终确定 COX2 和 GRSF1 影响 HSV-1 复制的具体分子途径。【结果】I1. 双荧光素酶报告系统实验结果表明 HSV-1 感染后，hsa-miR-101-2 启动子活性显著增强；2. 双荧光素酶报告系统实验结果表明过表达 HSV-1 即刻早期蛋白 ICP4 可以促 进 hsa-miR-101-2 启动子活性，qRT-PCR 实验结果显示过表达 ICP4 可以促进 hsa-miR-101-2 及其宿主基因的表达；3. 染色质免疫共沉淀实验(ChIP)及凝胶电泳迁移实验(EMSA)结果表明 ICP4 可 以直接结合 hsa-miR-101-2 启动子序列；4. 病毒滴定实验，免疫荧光实验，western blot 实验结果表明 GRSF1 可以促进HSV-1 复制，而 COX2 可以抑制 HSV-1 复制；5. qRT-PCR 实验结果表明 COX2 可以促进 I/III 型干扰素的表达；6. Western blot 实验结果表明 GRSF1 可以促进 HSV-1 衣壳蛋白 p40 的表达水平；7. RNA