hvegf165hbd3双基因修饰bmscs及其对放创复合伤的促愈作用研究-study on h vegf 165 hbd 3 double gene modified bms cs and its effect on wound healing.docx

hVEGF165/hBD-3 双基因修饰 BMSCs 及其对放创复合伤的促愈作用研究*摘要随着社会的发展进步，人们对全身和局部的电离损伤的担心愈来愈大，这些电离损 伤来源于：核电站事故、恶性肿瘤治疗性的辐射、长时间的X线透视、核医学中过量放 射性材料的吸入、核爆炸性恐怖事件等。机体损伤后出现协调的愈合过程，其中包括多 种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用。正常创面愈合是由旁分泌或 自分泌的许多细胞因子或生长因子介导和调控的级联放大反应实现的。放创复合伤难愈 创面的愈合过程紊乱，修复细胞数量减少或功能受损，导致对创面愈合起重要作用的生 长因子合成降低，胶原合成和炎性细胞减少等。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）促进伤口愈合的功能性特征包括：能够移行到创伤或 炎症的部位，参与受损组织的再生与重建，刺激固有的祖细胞增殖和向不同方向分化， 通过分泌生长因子和重新塑造细胞来促进受损细胞的恢复，发挥特殊的免疫调节和抗炎 作用。有效地把BMSCs作为一种修复细胞和/或外源基因表达的载体来运用于临床是目 前的一个研究热点。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的 功能是作为促内皮细胞分裂剂，趋化性媒介物和血管渗透性的诱导物，它是在创伤愈合 级联中唯一的起多重功能作用的因子，包括血管发生、内皮形成和胶原沉积。局部微生 物的持续感染也是创面难愈或不愈的原因之一。防御素富含正电荷，作用于细胞膜，具 有广谱高效的杀菌活性。由于其独特的作用机制，几乎无耐药性，其中人β防御素3（human beta defensins，hBD-3）在人类预防和治疗感染性疾病方面发挥了重要作用，其在很小 剂量范围内就表现出对革兰阳性菌的抗菌活性，同时其抗菌活性是非盐离子浓度敏感性 的，也不引起溶血，分子量小，合成快，弥散快，不伤害人体组织细胞，是理想的抗感 染的活性抗菌肽。研究显示hBD-3的重组体和化学合成的hBD-3 的抗菌性和生物学特性 与分离出来的天然肽没有区别。为了研究促进放创复合伤等慢性难愈性损伤的愈合，我们构建了 pVIVO1-hVEGF165-hBD-3真核质粒载体，用于转染大鼠的BMSCs，并将hVEGF165/hBD-3*本研究受国家自然科学基金和重庆市自然科学基金（2006BB5095）资助。基因修饰的BMSCs移植到大鼠放创复合伤的伤口皮下，以期大量合成释放hVEGF165和hBD-3，共同促进创面愈合。主要方法和结果如下：1．hVEGF165/hBD-3 双基因共表达真核质粒载体的构建和鉴定。利用 RT-PCR 方法 分别从白血病细胞（HL60）和牙龈组织中扩增出 hVEGF165 和 hBD-3 基因片段， 通过 DNA 重组技术将基因片段先后重组于 pVIVO1-mcs 真核表达载体上，构建成重组质粒 载体 pVIVO1-hVEGF165 和 pVIVO1-hVEGF165-hBD-3，分别用酶切电泳分析及 DNA 测序 的方法对重组质粒载体进行鉴定。运用 jetPEI 转染试剂将重组质粒转染 BMSCs 后，采 用 RT-PCR、免疫荧光细胞化学和 Western blot 方法证实重组真核质粒转染 BMSCs 后， 能成功高表达外源基因 hVEGF165 和 hBD-3。2．重组质粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3转染BMSCs后表达产物活性鉴定。分别收集 转染重组质粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3（T）、转染重组质粒pVIVO1-hVEGF165（C1）、 转染空载体（C2）以及正常未转染（N）的BMSCs无血清培养上清，分别命名为T-CM， C1-CM，C2-CM和N-CM。为了检测分泌出的hVEGF165能刺激细胞增殖和移行，另外设 立了一组T-CM/Ab，即T-CM 中加入hVEGF165中和抗体，用来阻断hVEGF165的作用效应。 将生长状态良好的内皮细胞EA.hy926按4×103 /孔接种于含有100 μL /孔完全培养基的96 孔板中。常规培养24小时后，每孔更换上述5种条件培养基，按CCK-8试剂盒的说明连 续检测5d以观察增殖效应。结果显示：与 C2-CM 、N-CM 和T-CM/Ab组相比，T-CM 和C1-CM组在第1-4d能够显著的促进细胞增殖（p0.05），表明表达的外源基因hVEGF165 有促进细胞增殖的作用。将内皮细胞EA.hy926接种于12孔板，待其达到95%的融合时， 用一无菌的1mL移液头，在培养板孔中央垂直交叉划出一个“十”，使单层细胞形成划痕， 再用PBS冲洗2次，之后再每孔中加入1 mL上