hsamir129抑制人肾癌sn12pm6细胞相关分子机制的初步研究-preliminary study on molecular mechanism of h samir 129 inhibiting sn 12 pm 6 cells in human renal carcinoma.docx

前言MicroRNAs(miRNAs)是一类分布十分广泛的大约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，有调节细胞早期发育，参与细胞分化和组织发育，调控基因表达的生物功能。它们在不同类型的肿瘤中被鉴定出来。在不同的肿瘤中，不同的miRNAs可以起到癌基因或者抑癌基因的作用。不过，miRNA通常负性调节基因的表达，可能发挥其他相关抑癌基因的作用。该课题前期结果示[1]：Hsa-mir-129抑制肾癌SN12-PM6细胞的生长。Hsa-mir-129经脂质体介导的方式转染肾癌细胞株SN12-PM6后，其生长明显迟缓，细胞的粘附能力、细胞的浸润及迁移能力明显减弱。Hsa-mir-129并能抑制人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型移植瘤的生长与肺部转移瘤的形成。但其分子水平的作用机制不详。在前期的试验基础上，本试验进一步研究Hsa-mir-129抑制肾癌SN12-PM6细胞的分子机制。将293T细胞及SN12-PM6细胞分别设空白组(未作处理正常细胞)、阴性组(转染空载体质粒)、实验组(转染携带hsa-mir-129质粒)三组。应用lipofectamine2000MT将Hsa-mir-129(GFP)及空白质粒载体(GFP)分别转染至293T细胞及SN12-PM6细胞。转染24—48小时后，荧光显微镜下观察转染效率。噻唑蓝(MTT)法测定SN12-PM6细胞的增值抑制率。流式细胞仪检测293T细胞及SN12-PM6细胞的细胞周期。分析细胞周期结果，进而设计引物，RT-PCR测定基因P53，P21，Rb1及CyclinD1表达的变化。从而了解Hsa-mir-129抑制肾癌SN12-PM6细胞的相关机制。华中科技大学硕士学位论文理论分析MicroRNAs（miRNAs）是一类分布十分广泛的大约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，通过作用于特异的mRNAs进而调控靶基因的表达或翻译。miRNAs在动物、植物、病毒中广泛存在，其序列高度保守。miRNAs能调控真核生物基因的表达，在细胞的增殖、分化及调亡等方面有重要的作用,与肿瘤的发生发展预后有关。miRNAs在细胞的早期分化、组织的生长发育和基因的表达调控过程中发挥着非常重要的调节作用。目前的研究证实肿瘤的发生发展与miRNAs之间存在着错综复杂的联系。miRNAs在不同类型的肿瘤中被鉴定出来。miRNAs可以调节基因的表达，起到癌基因或者抑癌基因的作用，即在肿瘤组织中表达上调的miRNAs可能起到癌基因的作用，可以导致肿瘤的发生及参与了肿瘤的发展过程。表达下调的那部分miRNAs可能是肿瘤的抑制基因，可能抑制肿瘤的发生与发展的作用，起到抑制肿瘤的作用。在不同的肿瘤中，不同的miRNAs通常负性调节基因的表达。miRNAs的表达存在时间与组织的特异性。一些miRNA由于具有特异性的时空表达的特点，已被证实在细胞分化和组织发育中起重要作用。miRNAs的表达谱能反映肿瘤组织的来源，从一个方面说明了肿瘤组织中miRNAs的表达存在组织的特异性。肿瘤组织中也有部分的miRNAs的表达与正常组织相一致。同一种miRNAs在不同的肿瘤组织中可以表达上调也可以表达下调，这可能与miRNAs调节的靶位点不同有关。相关研究提示，同一miRNAs可以调控多个mRNA分子，不同的miRNAs分子也可以协同调控相同的mRNA分子。起到控制细胞生长分化及增殖的作用。miRNAs与肿瘤的发生发展预后存在密切的关系。一般地，miRNAs的表达下调甚至缺失可能导致肿瘤的发生。细胞周期在机体的生长发育、细胞凋亡和分化等生理过程中起重要作用，并与肿瘤和病毒感染性疾病密切相关。一个细胞周期包括间期和有丝分裂期，间期包括G1、S和G2期。G1期的细胞也可能处于一种静息状态，细胞不生长，也不分化，称之为G0期。G1期主要为DNA合成作准备，S期主要为DNA成阶段，G2期主要为蛋白质合成阶段，为进入有丝分裂期作准备。细胞周期调控的关键分子主要有3大类:细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)、细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependentkinaseinhibitor,CKI)。CDK类蛋白激酶起催化亚单位作用，细胞周期素（Cyclins)起调节亚单位作用，CDK抑制因子（CKI）起抑制CDK激酶活性作用。CDKs在细胞周期中含量相对恒定，是调控网络的核心，它的激活依赖cyclins。Cyclins在细胞周期中含量周期性变化，对细胞周期中起着关键作用。Cyclins与相应的CDK结合，激活CDK的激酶活性，对细胞内特定底物进行磷酸化后，通过泛素依赖性的蛋白酶水解途径降解失活。CKI在细胞周期适当时间点上抑制CDK的活性，从而在细胞周期进程中起着重要作用