hpv16e6e7sirna 对宫颈癌 caski 细胞 pdl1表达及免疫调节作用的实验研究-experimental study of hpv 16e6 e7s irna on expression and immunoregulation of pdl 1 in cervical cancer caseki cells.docx

三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：内容摘要目的：宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，每年全球约有50万新诊断的子宫颈癌患者，接近27万人死于子宫颈癌，因此，需要更有效的治疗宫颈癌的相关策略。人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素，整合到人染色体后，其原癌基因E6、E7及所表达的原癌蛋白在宫颈癌的发生和发展过程中起重要的作用。目前虽然已有多种肿瘤疫苗进入临床验证，但许多疗效不尽如人意，其原因一方面是肿瘤诱导的免疫抑制，T细胞免疫功能缺陷，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控，限制了肿瘤免疫治疗效果。涉及HPV免疫识别和免疫调节的分子包括MHC、共刺激分子B7、粘附分子和细胞因子。其中共刺激分子PD-L1（程序性死亡配体1）/PD-1是重要的负性信号途径，抑制肿瘤特异性T细胞的功能，使肿瘤细胞逃避CTL的杀伤。因而本研究运用RNA干扰技术沉默HPV感染宫颈癌Caski细胞的癌基因E6/E7，将其作为肿瘤抗原与人淋巴细胞混合培养，是否能促进肿瘤特异性T细胞增殖以及淋巴细胞的细胞毒活性，并探索其机制是否是通过阻断PD-L1的高表达，为肿瘤的特异性免疫治疗提供新的机制和一个有希望的策略。方法:(1)在组织水平用免疫组化染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测HPV16E6/E7及PD-L1的表达情况；(2)利用RNA干扰技术设计并构建靶向HPV16E6/E7基因的siRNA重组质粒，并将其转染宫颈癌Caski细胞，经潮霉素筛选，通过RT-PCR、流式细胞术检测HPV16E6/E7基因的siRNA序列对E6/E7基因表达的沉默效果。（3）用MTT法，流式细胞术，淋巴细胞增殖实验以及CTL杀伤活性来检测沉默E6/E7基因后Caski细胞的生物学活性；(4)流式细胞术及RT-PCR的方法检测E6/E7基因沉默后对Caski细胞中PD-L1表达的影响。采用共转染法将PD-L1的荧光报告基因转染E6/E7基因沉默后的Caski细胞，通过测定荧光值（RLU）进一步评价PD-L1蛋白的表达变化。结果：(1)临床样品的组织水平：在癌症组、CIN组均有PD-L1、HPV16E6/E7的表达，有统计学意义（P0.01）；且PD-L1与HPV16E6/E7之间的表达有一定的正相关性(r=0.531，P＜0.01)；(2)构建靶向E6/E7基因的siRNA重组质粒，重组质粒转染Caski细胞，经过潮霉素筛选获得稳定细胞株。RT-PCR和流式细胞术分析显示构建的两个siRNA重组质粒均可分别有效下调E6/E7的表达；(3)MTT法检测获得的克隆细胞株Caski-E6/E7si与阴性对照Caski-si-ctl细胞株比较，有明显的生长抑制（P0.05）；流式细胞术检测克隆细胞株的细胞周期，结果显示Caski-E7si细胞株与对照比较有明显的凋亡峰，其差异有统计学意义（P0.01），而Caski-E6si与对照Caski-si-ctl细胞株间比较，其细胞周期没有明显的变化，无统计学差异（P0.05）。在混合淋巴细胞共培养实验中，克隆细胞株Caski-E6/E7si均能促进淋巴细胞增殖，且两者的CTL杀伤活性要比阴性对照明显增强（P0.05）。(4)流式细胞术和RT-PCR方法检测克隆细胞株Caski-E6/E7si均下调PD-L1的表达，同时下调了PD-L1的启动子活性。结论：沉默宫颈癌Caski细胞中HPV16E6/E7基因的表达后，与人混合淋巴细胞共培养，可以促进淋巴细胞的增殖，增加淋巴细胞CTL的杀伤活性；同时检测宫颈癌组织及Caski细胞中免疫负向调节分子PD-L1的表达，发现宫颈癌组织中的PD-L1的表达较对照组高，并且HPV16E6/E7si克隆细胞株中PD-L1的表达与Caski细胞比较有明显下调，可见宫颈癌Caski细胞中的HPV1