hpv16 e6蛋白与hdaxx在hela细胞共定位及对凋亡的影响-co - localization of hpv 16e6 protein and hdaxx in hela cells and its influence on apoptosis.docx

PAGEpolyacrylamide gelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosophate buffered saline磷酸盐缓冲液PIpropidium iodide碘化丙啶PMSFphenylmethyl sulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物rpmrevolutions per minute每分钟转数RPMI-1640roswell park memorial institute 1640 mediumRPMI-1640 培养基SDSsodium dodecyl sulphate十二烷基硫酸钠TBSTris-buffered salineTris 缓冲盐溶液TBSTTris-tween-20 buffered salineTris-吐温 20 缓冲盐溶液TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineN,N,N′,N′-四甲基乙胺TrisTris-(hydroxymethyl) aminomethane三羟甲基氨基甲烷TNFtumor necrosis facter肿瘤坏死因子W/Vweight/volume质量/体积HPV16 E6 蛋白与 hDaxx 在 HeLa 细胞共定位及对凋亡的影响硕士研究生：陈苏芳导师：万艳平教授中文摘要目的：分析人乳头瘤病毒 16 型（HPV16）E6 蛋白与 hDaxx 在 HeLa 细胞中的分布 与定位，探讨两蛋白高表达对 TNF-α 诱导 HeLa 细胞凋亡的影响，为进一步研究 E6 蛋白在 HPV16 致癌机制中的作用奠定实验基础。方法：(1) 采 用 脂 质 体 法 分 别 瞬 时 转 染 重 组 质 粒 pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6 或 pEGFP-C1/hDaxx，Western blot 检测 DsRed-HPV16 E6 和 EGFP-hDaxx 融合蛋白在 HeLa 细胞中的表达。(2) 瞬时转染或共转染 pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6 与 pEGFP-C1/hDaxx，激光共 聚焦显微镜观察 HPV16 E6 蛋白与 hDaxx 在 HeLa 细胞中的分布，并分析共定位。 (3) HPV16 E6 与 hDaxx 真核细胞表达质粒瞬时共转染 HeLa 细胞，MTT 法测定细胞 增殖活性。(4) 用 Hoechst 33258 染色细胞核，在荧光显微镜下观察细胞核形态，并对活细胞和凋亡细胞分别计数，计算凋亡率。分别将 0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx 和 2.0μg pcDNA3.1(-)/HPV16 E6 瞬时共转染 HeLa 细胞，以空细胞组、pcDNA3.1(-) 转染组和 pcDNA3.1(-)/hDaxx 转染组作为对照，TNF-α 处理 12h 后分别收集各组细胞， 经 70％的乙醇 4℃固定过夜，PI 染色后，用流式细胞术检测凋亡。(5) 按(4)法转染 HeLa 细胞，TNF-α 处理细胞 12h 后，检测 caspase-8 与 caspase-3 的 相对活性。结果：(1) Western-blot 结果显示 HPV16 E6 和 hDaxx 重组质粒转染组均出现了免疫反应带，而空质粒转染组和 HeLa 细胞组未见免疫反应带。(2) 在激光共聚焦显微镜下，DsRed-HPV16 E6 融合蛋白所发的红色荧光主要分布于 胞核，EGFP-hDaxx 融合蛋白所发的绿色荧光仅分布于胞核；HPV16 E6 和 hDaxx 共 转染组，绿色荧光和红色荧光在胞浆较弱呈均匀分布，在胞核较强且集中分布在核膜 附近，红色荧光同绿色荧光融合成黄色荧光。(3) 与 HPV16 E6 转染组比较，HPV16 E6 与 hDaxx 共转染时，细胞增殖活性降低， 差异有统计学意义（P0.05）。(4) TNF-α 处理的各组细胞均可见胞核呈现深染、致密的颗粒块状荧光的凋亡细胞。pcDNA3.1(-)/E6 转染组凋亡率低于 pcDNA3.1(-)转染组，差异有统计学意义（P0.05）； 与 E6 转 染 组 相 比 ， 共 转 染 组 凋 亡 率 显 著 升 高 （ P0.01 ）， 且凋亡率 随 pcDNA3.1(-)/hDaxx 转染量的增加而升高。(5) 与空载体组相比，E6 转染组 caspase-8 和 caspase-3 两种酶活性均显著降低（ P0.01 ）；与 E6 转染 组 相 比 ， 共 转 染 组 caspase-8 和 caspase-3 相 对 活 性 随pcDNA3.1(-)/hDaxx 转染量增加而升高；当 hDaxx 为 2.0μg 时，差异具有统计学意义（P0.01