家蚕微孢子虫孢壁蛋白swp26及其宿主互作蛋白的分析-analysis of sporoderm protein swp26 of nosema bombycis and its host interaction protein.docx

江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江 苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)必威体育官网网址□，在年解密后适用本授权书。 (2)不必威体育官网网址?。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物，具有广泛的寄主域，包括脊 椎动物和无脊椎动物。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是引起家蚕微粒子病的病原 体，可以通过胚胎垂直传播，被蚕业生产国列为唯一的法定检疫对象。目前，微粒子 病依然给我国和印度两个蚕丝大国的蚕丝业造成巨大的经济损失。自 19 世纪中期首次发现家蚕微孢子虫以来，人们对微孢子虫的研究已有 150 多年的历史。成熟孢子是微孢子虫唯一在细胞外的生活阶段，其外被厚厚的孢子壁。孢子壁的存在可以使成熟微 孢子虫抵抗外界任何不良环境，使其在恶劣环境中生存很长时间。微孢子虫的孢壁位 于孢子的最外层，主要由高密度电子层的蛋白质成分的孢子外壁和低电子密度的蛋白 质和几丁质成分的孢子内壁组成。坚硬的孢子壁不但可以保护孢子抵抗各种外界压力， 而且在维持微孢子虫孢内渗透压的平衡中也起着重要作用。最近研究表明，位于微孢 子虫孢壁结构的一些孢壁蛋白在微孢子虫的侵染机制和孢子黏附的过程中扮演着重要 的角色。SWP26 是一种 C-端含有一个肝素结合基序的家蚕微孢子虫孢壁蛋白，肝素结 合基序能识别并结合宿主细胞表面的葡聚糖，从而介导孢子粘附和宿主细胞的感染。 免疫胶体金标记的方法发现，孢壁蛋白 SWP26 在成熟孢子与未成熟孢子中均有表达， 在孢壁的发育过程中孢子内外壁也均有 SWP26 蛋白的分布。这暗示着，家蚕微孢子虫 孢壁蛋白 SWP26 在孢子壁的形成过程以及孢子黏附和宿主细胞的侵染过程中可能扮 演着重要的角色。本文通过家蚕微孢子虫孢壁蛋白 SWP26 的时相表达分析发现，家蚕中肠组织在感 染微孢子虫后的 24 h 就可以检测到 SWP26 的转录本，表明该孢壁蛋白可能在孢子裂 殖体阶段就需要发挥作用，这与 SWP26 在家蚕微孢子虫不同发育阶段的亚细胞定位相 一致。然而，目前对家蚕微孢子虫 SWP26 与其宿主蛋白之间的分子作用依然知之甚少。 在此，我们希望通过实验去了解孢壁蛋白 SWP26 与宿主蛋白之间是否存在着直接的相 互作用。试验中我们利用家蚕核型多角体病毒 Bac-to-Bac 表达系统，将家蚕微孢子虫孢壁 蛋白 SWP26 基因和绿色荧光蛋白报告基因 EGFP 克隆到杆状病毒转移载体 pFastBac1， 并转化 DHI0BmBac 感受态细胞，经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒 vBmEGFP-SWP26，随后将其转染家蚕细胞 BmN 获得含有目的基因的重组杆状病毒。用 SDS和 Western-blot 方法在感染重组病毒的家蚕 BmN 细胞中检测到大小约 51 kDa 的重组蛋白条带。结果表明，家蚕微孢子虫孢壁蛋白 SWP26 基因可在 BmN 细胞 中成功表达，这为继续研究其功能以及在细胞水平通过免疫共沉淀方法筛选与之互作I的宿主蛋白奠定了基础。随后，利用 EGFP 作为抗原决定簇通过免疫共沉淀技术筛选与之相互作用的宿主 细胞蛋白。通过免疫共沉淀实验，我们筛选到一个与 SWP26 有相互作用的家蚕类海龟 蛋白（Bombyx mori turtle-like protein，BmTLP）。经酵母双杂交实验结果证实，家蚕微 孢子虫孢壁蛋白 SWP26 与家蚕类海龟蛋白 BmTLP 之间的确存在相互作用。完整家蚕 类海龟蛋白开放式阅读框长 1 344 bp，编码 447 个氨基酸的蛋白质，分子量大小约为49.6 kDa，等电点为 5.55，在其 N-端有一段长为 27 个氨基酸残基的信号肽序列，27 和 28 氨基酸位点之间为裂解位点。通过在线 BLASTp 比对分析发现，BmTLP 蛋白与 相应鳞翅目昆虫大红斑蝶（Danaus plexippus）海龟蛋白序列的同源性高达 98%（基因 登录号：EHJ71750），与膜翅目模式昆虫黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）海龟蛋 白序列的同源性也达到了 84%（基因登录号：ACN43741）。经在线软件 NetNGlyc 1.0 预 测该 cDNA 所编码的氨基酸序列具有 5 个潜在的 N-糖基化位点，推测 BmTLP 蛋白很 可能是一种分泌型的糖蛋白。SMART 软件分析结果表明，BmTLP 蛋白具有免疫球蛋 白超家族（Immunoglobulin Superfa