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实验十二、 大肠杆菌生长曲线的制作 一、实验目的 了解大肠杆菌的生长特性与规律，绘制生长曲线 掌握光电比浊法测量细菌数量的方法 生长曲线 将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作图，得到一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 一个典型的生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期 二、实验原理 微生物生长曲线示意图 1、延迟期  特点：生长速率常为零、菌体粗大、RNA含量增加、代谢活力强、对不良环境的抵抗能力下降。 成因：微生物刚刚接种到培养基之上，其代谢系统需要适应新的环境，同时要合成酶、辅酶、其他代谢中间代谢产物等，所以此时期的细胞数目没有增加。 2、对数期  特点：生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、活细菌数和总细菌数大致接近、细胞的化学组成形态理化性质基本一致。 成因:经过调整期的准备，为此时期的微生物生长提供了足够的物质基础，同时外界环境也是最佳状态。 3、稳定期 特点：活细菌数保持相对稳定、总细菌数达到最高水平、细胞代谢产物积累达到最高峰、是生产的收获期。 成因：营养的消耗使营养物比例失调、有害代谢产物积累、PH值等理化条件不适宜。 4、衰亡期  特点:细菌死亡速度大于新生成的速度、整个群体出现负增长、细胞开始畸形、细胞死亡出现自溶现象。 成因：主要是外界环境对继续生长越来越不利、细胞的分解代谢大于合成代谢、继而导致大量细菌死亡。 根据微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律，对生产实践具有重大的指导意义。 根据对数期的生长规律可以得到培养菌种时缩短工期的方法:接种对数期的菌种,采用最适菌龄，加大接种量，用与培养菌种相同组成的培养基。 根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产物的最佳收获期，也是最佳测定期，通过对稳定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创建。 微生物数量的测定方法 平板菌落计数法 显微镜直接计数法 光电比浊法 平板菌落计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：活菌计数方法，对设备要求不高。 缺点：操作复杂。 显微镜直接计数法 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。 光电比浊法 光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。 优点：简便快速，适合于自动控制。 缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。  利用一系列菌悬液测定光密度和菌数，制作标准曲线，再根据被测样的光密度计算出含菌量。 光合细菌菌株NS的生长曲线 三、实验器材 菌种 培养不同时段的大肠杆菌。 仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。 四、实验步骤 开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 nm处。 打开样品室，将挡光体插入比色皿架，将其推或拉入光路。 盖好样品室盖，按0%键调零透射比。 取出挡光体，按100%键调100%透射比。 1.样品测试前的调试 2.样品测定 将参比溶液（未接种的LB液体培养基）以及被测溶液倒入比色皿中。 打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。 将参比溶液推入光路，按100%键调满度。 将测试方式调至吸光度方式。此时,显示器显示“0.000”。 将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样品的吸光值。 在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值在0.1-0.65范围内。 比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。 五、作业 1、结果 P88 记录不同大肠杆菌培养液的OD600值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。 2、思考题 第1题