质粒酶切回收及连接2.pptVIP

基础知识 DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法获得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。 实验内容 1、命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 1．识别位点：一般长4～6bp，回文结构。 5’-CTGCAG-3’ 5’-GTTAAC-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-CAATTG-5’ 2．切割结果： 粘端切口，即两链的切口错开2～4个核苷酸 平端切口，即在同一水平切割DNA双链 （二）影响限制性内切酶酶切的反应条件 1、DNA限制性内切酶 2、酶作用底物 3、反应缓冲液 4、盐离子浓度 5、酶解温度与时间 （二）影响限制性内切酶酶切的反应条件 4.盐离子浓度 不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求.一般按离子强度不同分为低（10mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。 （三）酶切体系 根据实验需要选择 DNA底物 限制性内切酶 10X Buffer：酶切缓冲液，H/M/L ddH2O：补齐 实验用质粒的结构 pBR322---作为目的基因供体 经HindⅢ及PstI切割后得779bp及3.6kb两片段，其中779bp做为本实验的目的基因。 pUC18---作为载体 pUC18经HindⅢ和Pst I酶切割后，得18bp和2.67kb两片段，2.67kb作为本实验的载体。 HindⅢ识别序列： 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 粘性末端 5-A AGCTT-3 3-TTCGA A-5 （四）实验步骤 (四) 实验步骤 2．用PstⅠ 酶切 向上述酶切体系中加入1/10体积(4μL)的3mol/L NaAC溶液混匀  ↓ 加入2倍体积(80μL)的无水乙醇,室温放置10min ↓离心12000rpm/10min  去上清,向沉淀(DNA)中加入70%乙醇1ml洗涤(离心12000rpm/5min)倒净液体,扣干  ↓(注:如果沉淀被冲开需再离心，12000rpm，2min，70％乙醇洗涤，可重复2～3次)  室温放置15～30min，自然干燥  ↓ 加10μL 1×TE溶液溶解DNA  加入10×O buffer 2μL, 双蒸水6μL，PstⅠ2μL (12U/μL)  ↓(终体积为20μL)  37℃水浴1.5h，用电泳检查酶切结果 酶切注意事项 ① 根据实验目的选用内切酶;选择合适buffer ② -20℃冰箱中保存，使用时应置于冰中。 ③ 枪尖不能反复使用。 ④ 加完酶后要在离心机上“甩”一下 ⑤ 所加酶体积不应超过总酶切体系的1/10,甘油影响。 ⑥酶切底物DNA要纯，DNA纯度会影响酶切结果。 ⑦ 置于最适作用温度下酶切。 ⑧ 尽量减少操作时间。 酶切结果的鉴定--琼脂糖凝胶电泳 二、目的DNA片段的回收 实验目的：掌握从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的方法 三、 DNA的连接 用DNA连接酶将目的基因与载体连接?重组子。 实验原理 DNA连接酶的分类 T4 DNA连接酶 1.来源 T4噬菌体感染的大肠杆菌； 2.最佳pH值 7.2～7.8,常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液； 3.需ATP,Mg2+参加反应； 4.二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的 连接作用； 5.高浓度的Na+,K+等抑制酶的活性。 连接体系 目的DNA： 6μl 载体DNA: 2μl 10ⅹligation buffer: 1μl ddH2O: 0μl T4 DNA连接酶: 1μl 实验操作流程 HindIII酶切pBR322 ↓ 回收目的片断 ↓ PstI酶切pBR322 ↓ 电泳鉴定、切胶回收 目的片段779bp 连接反应的要求和注意事项 DEAE膜插片法 －－500～5kb片段 电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 柱层析法 实验原理： 利用硅胶膜选择性吸附的特性，当含有目的DNA 的凝胶溶液，经过装有硅胶膜的收