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霍乱弧菌Fosmid文库的构建、分析及应用摘要霍乱，又称为亚细亚霍乱或传染性霍乱，是主要由O1和O139血清型霍乱弧菌引起的一种烈性、猝发性的细菌性传染病，其危害仅次于鼠疫。随着环境和人类生活方式的转变，霍乱弧菌已经出现了细菌毒力、菌落特征等方面的变异。而随着分子生物学的发展，霍乱弧菌的检测方法也从传统的表型特征鉴定向遗传特征基因鉴定转变。为了能够准确、快速、安全的检测霍乱弧菌，特别是产毒型霍乱弧菌，本研究首先从分子生物学水平构建了包含霍乱弧菌全套基因的Fosmid 文库，使霍乱弧菌遗传信息转移到易于培养的大肠杆菌中去；通过基因水平的筛选，获得了霍乱弧菌常见的5 种高度保守特征基因。为了满足普通实验室对霍乱弧菌阳性对照的需求，本论文对筛选出的5种霍乱弧菌保守基因的Fosmid 质粒进行稳定性研究，制备出可作为阳性对照的霍乱弧菌Fosmid 质粒标准样品并以制备的tcpA-Fosmid 质粒标准样品为模板，通过对传统切刻内切恒温扩增技术（NEMA）的优化和改良，建立一种新型的O1和O139型霍乱弧菌的切刻内切恒温扩增（NEMA）快速检测方法。1. 选取O1 和O139 型霍乱弧菌为研究对象，利用低熔点琼脂糖包埋法获得高质量的O1 和O139型霍乱弧菌基因组DNA，用随机剪切法将基因组进行片段化处理，脉冲电泳分离片段化DNA并切胶回收33kb~48kb之间的DNA片段，然后对DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理，与pCC1FOS载体连接，经包装、转染、筛选阳性克隆构建霍乱弧菌Fosmid 文库。所建的Fosmid 文库库容量为355Mb，平均插入片段为35kb，共保存9600个克隆，空载率小于2%。经稳定性实验证明所建文库克隆能够稳定繁殖。为下一步O1和O139型霍乱弧菌目的基因的筛选、文库的应用研究奠定了基础。2.利用实时荧光PCR从霍乱弧菌Fosmid文库中筛选出含tcpA、ctxAB、hlyA、rfb-O1 和rfb-O139保守性特征基因的阳性克隆菌株，通过提取Fosmid 质粒并对其稳定性进行研究，最终研制出具有较好稳定性的含有霍乱弧菌tcpA基因、hlyA 基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的Fosmid质粒标准样品。该质粒标准品的研制基本满足了实验室对霍乱弧菌阳性对照的需求。3. 选取已制备的tcpA-Fosmd 质粒标准样品为阳性模板，对传统NEMA技术进行了优化和改良。在参考传统的NEMA反应体系基础上，对影响扩增效率的关键因素—如温度、缓冲环境、镁离子及DMSO浓度分别进行了优化。经试验确定，以磷酸钾缓冲液作为缓冲环境，反应温度59℃、镁离子和DMSO 终浓度分别为5mmol/L、5%时扩增效率最高。为了弥补传统NEMA一步法容易形成引物二聚体的缺陷，本论文将传统的一步法体系改良为两步法，即在正式扩增前，引入了预反应步骤；用优化和改良的NEMA扩增体系对O1 和O139 型霍乱弧菌进行特异性和灵敏度研究，结果表明，所建立的NEMA技术对O1 和O139 型霍乱弧菌有很好的特异性和较好的灵敏度，随着该技术的进一步成熟，可以用于试剂盒等诊断产品的研发。关键词：霍乱弧菌；Fosmid 文库；NEMA技术Construction、analysisandapplicationoftheFosmidLibraryforVibriocholeraAbstractCholera,alsoknownasAsiaticcholeraorinfectiouscholera,isakindofacute bacterialinfectionsmainlycausedbytheO1andO139serotypeofVibriocholera,its harmranksonlysecondtoplague.Withthechangesintheenvironmentandhuman lifestyle,forVibriocholerae,therehavebeenthevariationsofcolonycharacteristics andvirulenceofbacteria.Withthedevelopmentofmolecularbiology,bacteria detectingmethodhaschangedfromtheappraisalofgeneralphenotypic characterizationtotheappraisalofthegeneticcharacteristicsofgene.Inorderto accurately,quickly,safelydetectVibriocholerae,especially toxigenicVibriocholerae, aVibr