合江棘蛙paa robertingericathelicidin家族抗菌肽的基因克隆 结构与生物功能研究word格式论文.docxVIP

6 抗氧化活性 48第四节 结果与分析 481 抗菌活性 482 溶血活性 513 红细胞凝集活性 514 DPPH 自由基清除活性 52总 结 54讨 论 55本研究创新点 60参考文献 61攻读学位期间发表的论文 69致 谢 70摘 要合江棘蛙（Paa robertingeri）(Anura: Ranidae)为蛙科棘蛙属物种， 仅分布于云贵高原的四川、云南和重庆等少数地区，属中国特有种， 其数量稀少，保护级别为濒危。Cathelicidin 抗菌肽是一种特殊的抗菌 肽大家族，由保守的 N-端信号肽区域，高度保守的“cathelin”间隔肽 区域和高度特异的 C-末端成熟肽区域组成，经酶切作用释放出成熟 肽。成熟肽在大多数脊椎动物的先天性免疫系统中发挥着重要作用， 作为抵抗病原菌入侵和抵御其他外界伤害的第一道防线。目前几乎在 所有脊椎动物，包括人、哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中均有发现， 但在两栖类中关于 cathelicidin 的报道极少，仅在棕点湍蛙（Amolops loloensis）、脆皮大头蛙（Limnonectes fragilis）、双团棘胸蛙（Paa yunnanensis）、牛蛙（Rana catesbeiana）和红瘰疣螈（Tylototriton verrucosus）体内有报道 cathelicidins 抗菌肽。在本论文中，对合江棘 蛙 cathelicidins 抗菌肽进行了结构、功能等初步研究。从合江棘蛙皮肤组织提取总 RNA，构建了皮肤 cDNA 文库，根 据 cathelicidin 家族基因序列特征设计引物，使用半巢氏 PCR 的方法， 克隆到了两条编码 cathelicidins 前体的 cDNA 序列，经过分析比对， 推断出两条成熟肽序列：cathelicidin-PR1 和 cathelicidin-PR2，分别由29 个（ RKCNLFCKAKQKLKSLSSVIGTVVHPPRG ）和 25 个（KECKDYLCKLLMKLGSSSHIESIDP）氨基酸残基组成。进化分析 发现，合江棘蛙 cathelicidins 与双团棘胸蛙 cathelicidin 有很高的同源 性，两者在进化过程中亲缘关系最近，与物种分类吻合。合江棘蛙与 其他两栖类蛙科动物 cathelicidins 独立成一簇,与哺乳类、爬行类、鸟 类、鱼类来源的 cathelicidins 相互独立，与物种进化顺序略有不同， 为 cathelicidins 基因家族起源和进化提供了证据。Cathelicidin-PR1 和 cathelicidin-PR2 分子量均非常小，分别为 3195.88Da 和 2838.34Da，两者各有一条二硫键，圆二色谱检测显示 两者在无菌水溶液中均为无规则卷曲结构的二级结构，而在拟膜环境 的 SDS 溶液（60mM）中主要呈 α-螺旋结构，与理论预测结构相近，I这种结构对发挥杀菌作用发挥着重要作用。在供试的 13 株细菌和真菌中（含标准菌株和临床分离的耐药菌 株），化学合成的 cathelicidin-PR1 对大部分菌株均出现杀菌作用， 对 6 种菌（含细菌和真菌）显示较强抗性，特别是对临床分离的耐药 菌株，其最小抑菌浓度（MIC）可达到 11.73 μM；而 cathelicidin-PR2 则未检测到任何抗菌活性。杀菌动力学显示，在 5 倍 MIC 浓度时， cathelicidin-PR1 可在 45 min 内杀死临床分离蜡样芽孢杆菌，较氨苄 西林快（需 1.5 h 以上)。两者的溶血活性都极低，在浓度 100 μg/ml 时，cathelicidin-PR1 与 cathelicidin-PR2 溶血率分别为 3.87%、1.12%； 将浓度提高到 200 μg/ml 时，溶血率分别为 1.78%和 2.01%，充分说 明两者无溶血活性。红细胞凝集实验结果显示在无 Ca2+存在时， cathelicidin -PR1 无凝集活性，cathelicidin-PR2 有弱凝集活性；在有 Ca2+存在时，两者均无凝集活性。cathelicidin-PR1 和 cathelicidin-PR2 在 80 μg/ml 浓度对 DPPH 自由基清除率均极低，分别为 2.92%和 2.30%。以上活性说明 cathelicidin-PR1 有望成为一种多肽类抗菌药物 先导化合物，通过设计修饰开发出新型药物。关键词：合江棘蛙，抗菌肽，cathelicidin，克隆，结构与功能AbstractPaa robertingeri (Anura: Ranidae) is a member of Paa Dubois, which is distributed in Sichuan