cystatinb及其突变体g50e q71p与clic1相互作用的初步分析word格式论文.docxVIP

英文缩略词表Abbreviation英文缩写英文全称中文全称3-AT3-amino-1,2,4-triazole3-氨基三唑Ampampicillin氨苄青霉素ADactive domain转录活化结构域BDbinding domainDNA 结合结构域bpbase pair碱基对cDNAcomplementary deoxyribonucleic acid互补 DNACIAPcalf intestine alkaline phosphatase小牛肠碱性磷酸酶 DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole4,6-二脒基-2-苯基吲哚 DMSOdimethyl sulfoxide二甲基亚砜DOdrop-out mix营养缺陷混合物EBethidium bromide溴化乙锭 EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸 GFPgreen fluorescent protein绿色荧光蛋白Kankanamycin卡那霉素MOPS3-(N-morpholino) propanesulfonic acid3-(N-吗啡啉)乙磺酸 ODoptical density光密度PEGpolyethylene glycol聚乙二醇PCRpolymerase chain reaction聚合酶链式反应rpmrotation per minute每分钟转数PVDFpolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠Tris2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol 三羟基甲基氨基甲烷cystatin B 及其突变体 G50E、Q71P 与 CLIC1相互作用的初步研究中文摘要目的 为研究 cystatin B 蛋白的生物学功能，构建酵母表达载体，进行酵母双杂 交实验；构建带 FLAG 标签的 cystatin B 及其点突变体 G50E、Q71P 真核表达载体 和带 GFP 标签的 CLIC1 真核表达载体，将各种质粒瞬时转染至 COS7 细胞，观察 表达的蛋白在细胞内的定位；将 cystatin B 及突变体分别与 CLIC1 质粒共同瞬时转 染至 COS7 细胞，观察各组蛋白在细胞内的共定位情况；将三组质粒分别转染至 HEK 293T 细胞，用免疫共沉淀实验检测 cystatin B 蛋白及两种突变体与 CLIC1 蛋 白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。方法 用 PCR 方法，以含人 cystatin B 全长 cDNA 序列的质粒 pLenti6-cystatin B 为模板，扩增 cystatin B 全长序列，酶切回收目的片段，插入到载体 pGADT7、 pGBKT7 上，构建酵母表达载体 pGADT7-cystatin B 和 pGBKT7-cystatin B；用同 样方法构建真核表达载体 pCDNA3-cystatin B-FLAG、pCDGFP-CLIC1。用 PCR 方 法，用引入了点突变的引物，以 pCDNA3-cystatin B-FLAG 为模板，构建表达载体 pGADT7-G50E、pGBKT7-G50E、pCDNA3-G50E-FLAG；以同样方法构建表达载 体 pGADT7-Q71P、pGBKT7-Q71P、pCDA3-Q71P-FLAG。重组质粒经酶切鉴定正 确的送测序公司测序。将酵母表达质粒分组转化至酵母菌 AH109，在 SD/-Leu/-Trp/-His/3AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆为 α-gal 活性为阳性的克隆。分别将 pCDNA3-cystatin B-FLAG、pCDNA3-G50E-FLAG、pCDA3-Q71P-FLAG及 pCDGFP-CLIC1 四种质粒瞬时转染至 COS7 细胞，在荧光显微镜下观察各种蛋 白 的 细 胞 定 位 ； pCDNA3-cystatinB-FLAG 、 pCDNA3-G50E-FLAG及 pCDA3-Q71P-FLAG 分别与 pCDGFP-CLIC1 共同转染至 COS7 细胞，荧光显微镜 下观察各组蛋白在细胞内的共定位；将三组质粒共同瞬时转染至 HEK 293T 细胞， 通过免疫共沉淀实验检测 cystatin B 蛋白及其突变体与 CLIC1 蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。结果 酶切和测序图谱证明各载体均构建正确。在酵母细胞中，共表达 cystatin B 和 CLIC1 两种融合蛋白使细胞表现 α-半乳糖苷酶活性，共表达 G50E 和 CLIC1 及 Q71P 和 CLIC1 的细胞得到相同结果；在荧光显微镜下观察到，在 COS7 细胞中， CLIC1 蛋白主要分