cε3cε4蛋白核酸适配子筛选及功能分析word格式论文.docxVIP

摘要免疫球蛋白E（IgE）与其亲和力受体FcεRI的结合是触发变态反应的关键环节，以IgE/FcεRI信号通路为靶点设计药物，阻断IgE与FcεRI的结合及下游信号传递是目前治疗变态反应性疾病药物研究的热点。核酸适配子是通过SELEX技术筛选到的与靶物质特异性结合的单链DNA或RNA片段，其具有靶分子范围广、亲和力与特异性高、制备方便、易合成、易存储和修饰等优点，可用于阻断或促进靶物质生物活性以及对靶物质进行测定、纯化等方面，在生物医药研究领域具有广阔的应用前景。IgE分子Cε3-Cε4 区是与FcεRI结合的关键部位，本实验在已获得重组Cε3-Cε4 蛋白的基础上筛选与Cε3-Cε4 蛋白特异性结合的核酸适配子，拟通过该适配子与IgE结合从而干扰IgE/FcεRI信号通路的传递。具体过程是设计并合成80个核苷酸的随机ssDNA 文库，通过优化退火温度、循环次数、上下游引物比例等因素建立了适合本实验的最优PCR体系，然后以硝酸纤维素膜为筛选介质，通过SELEX技术筛选Cε3-Cε4 蛋白特异性核酸适配子。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮亲和力，将最后一轮筛选产物克隆测序并利用软件分析适配子的一级结构和二级结构。经过10 轮筛选，得到了Cε3-Cε4 蛋白特异性的适配子，且每轮亲和力呈上升趋势。根据一级结构同源性，适配子分为6 个家族。二级结构预测以茎环为主，这可能是适配子与蛋白作用的结构基础。ELISA测定各适配子亲和力，以所获高亲和力适配子分别作为捕获分子和检测分子建立了酶联适配子吸附试验方法，该法线性范围为250-2000ng·mL-1，灵敏度为120 ng·mL-1，可用于人IgE的定量检测。Western blotting结果显示高亲和力适配子对IgE具有较高的特异性，在此方法中适配子可取代抗IgE 抗体对IgE进行了检测。ELISA 方法测定了亲和力高的适配子的解离常数，结果显示，适配子A9 的Kd值低至9.79nM，有较高的亲和力，与上述结果相一致。分别于体内、外检测了鼠Cε3-Cε4 蛋白高亲和力适配子的生物学活性。大鼠被动皮肤反应实验结果显示，适配子治疗组能够明显改善致敏原引起的血管通透性增加，高、低剂量间具有显著差异，且适配子本身不引起变态反应。RBL-2H3细胞实验显示，适配子可抑制DNP-IgE/DNP诱导的脱颗粒反应，Ca2+浓度及β-氨基己糖苷酶释放率得到显著降低，且呈一定的剂量依赖性。本研究筛选得到了高亲和力、高特异性的Cε3-Cε4I蛋白核酸适配子，此适配子具有抑制变态反应的生物学活性，将为进一步探索IgE核酸适配子生物学功能奠定基础，并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供线索。关键词变态反应免疫球蛋白E配体指数级富集系统进化核酸适配子ⅡAbstractImmunoglobulinE(IgE)bindingwithitshighaffinityreceptor(FcεRI)istheimportant molecular mechanismsunderlyingallergicresponses,whichhasbeenelucidatedoverthepast severaldecades.Currentresearchisaimedatfindingmedicationstargetingspecificstepsin theIgE/FcεRIsignalingpathway. Therefore, manycandidatedrugs targetingweredesigned in ordertoblockIgE/FcεRIinteractionanditsdownstreamsignalingtransductionpathway. Aptamerisanoligonucleotideligandbindingtothetargetmoleculesspecifically,whichis selectedfroma randomsyntheticallyoligonucleotidelibrarybysystematicevolutionof ligands byexponential enrichment (SELEX). Aptamersare similar toantibodybutsuperiorin manyaspects,suchastheyhaveawiderangeoftargetmolecules,betteraffinityand specificity,easyproductionandmodification,morestableetal,whichmakethemimportant inmanyresearchesincludeofbl