cugbp1在人星形细胞瘤中的表达及其敲减后对u251细胞的影响机制研究word格式论文.docx

中 文 摘 要近年来，肿瘤发生的机制已经成为国内外学者关注的焦点，而从分子生物学角 度阐述肿瘤发生、发展等越来越受到重视。在我国，神经胶质瘤是神经系统的第一 大肿瘤，具有发病率高、进展快、预后差等特点，而且目前发病有上升趋势。作为 RNA 结合蛋白质 CELF 家族的一员，CUGBP1 在细胞核内通过刺激非连续外显子的保 留或删除而调节一些 mRNA 前体的选择性剪接；在细胞质中，通过结合到靶向 mRNA 的特定序列而调节一些 mRNA 的翻译或降解；还可通过 RNA 编辑酶而调节一些 mRNA 的编辑。CUGBP1 不仅在胚胎及心脏发育、骨骼肌及脂肪组织分化、生殖细胞形成等 方面具有重要的影响，而且在肝脏细胞及乳腺上皮细胞增殖甚至肿瘤形成以及一些 肿瘤的恶化中发挥作用。但其在人胶质瘤细胞中是否异常表达以及改变这种表达后 对胶质瘤有何影响，国内外尚未见相关报道。研究意义旨在分析 CUGBP1 在胶质瘤细胞中的表达水平，明确其与人胶质瘤的关系；同 时，从细胞增殖、细胞凋亡的现象及相关基因的变化解释 CUGBP1 与胶质瘤发生、 发展的关系。研究目的通过 CUGBP1 在不同胶质瘤细胞株、胶质瘤脑组织以及正常脑组织中的表达检 测和观察 CUGBP1 基因敲减后细胞增殖、细胞凋亡变化以及相关基因表达改变，分 析 CUGBP1 与胶质瘤发生的相关性，以阐明 CUGBP1 在胶质瘤发生、发展中的作用及 机制。实验方法1、表达检测 选择 RT-PCR 和实时定量 RT-PCR 方法从 mRNA 水平上观察并比较 CUGBP1 在不同胶质瘤细胞株、胶质瘤脑组织以及正常脑组织中的表达。半定量 RT-PCR 法检测 CUGBP1 在不同胶质瘤细胞株的表达，同时以管家基因 GAPDH 作为系统阳性对照。实时定量 RT-PCR 法检测 CUGBP1 在不同病理级别胶质瘤脑组织的表达水平，并 以正常脑组织中的水平作为参照标准，同时以 GAPDH 作为系统阳性对照。2、RNA 干扰慢病毒构建及其敲减效率检测 为进一步探索 CUGBP1 与胶质瘤的相 关性及其机制，构建 CUGBP1-shRNA 慢病毒，转染胶质瘤细胞株 U251，并检测其转 染及敲减效率。2.1 RNA 干扰慢病毒构建 设计干扰靶点序列，连接到慢病毒载体，包装成病毒 颗粒。2.2 细胞计数 运用普通光学显微镜和荧光显微镜观察和细胞计数，评估转染效率。2.3 实时定量 RT-PCR 法检测 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染胶质瘤细胞的敲减效 果。3、细胞增殖 CUGBP1 在某些病理情况下与肝脏及乳腺上皮细胞的增殖密切相 关，是否在胶质瘤发生中也有类似现象，我们通过 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染胶质 瘤细胞而敲减 CUGBP1 表达以揭示其与细胞增殖的关系。3.1 细胞计数，绘制 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染组及 Scr-shRNA 慢病毒转染组两 组细胞生长曲线，分析敲减对细胞生长的影响。3.2 双抗体夹心酶标免疫分析法测定转染 CUGBP1-shRNA 慢病毒的人胶质瘤细胞 BrdU 掺入的 OD 值，同时以 Scr-shRNA 慢病毒转染细胞作为阴性对照，分析敲减对 DNA 合成及细胞增殖的影响。4、细胞周期分布及细胞凋亡 CUGBP1 在强直性肌营养不良成肌细胞中使某些与 细胞周期退出相关的蛋白质如 P21 等表达或活性改变，进而使细胞周期退出障碍， 从而发生突变或异常增生的几率增加。这种现象是否也出现在胶质瘤细胞，我们通 过 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染胶质瘤细胞而敲减 CUGBP1 表达以揭示其与细胞周期分 布及细胞凋亡的关系。4.1 运用 FACS 检测 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染胶质瘤细胞后的细胞周期分布比 例，同时以转染 Scr-shRNA 慢病毒细胞作为阴性对照，分析敲减对细胞周期分布的 影响。4.2 运用 FACS 检测 CUGBP1-shRNA 慢病毒转染胶质瘤细胞后的细胞凋亡比例， 同时以转染 Scr-shRNA 慢病毒细胞作为阴性对照，分析敲减对细胞凋亡的影响5、细胞周期及细胞凋亡相关基因检测 为进一步探究 CUGBP1 与胶质瘤细胞增 殖和凋亡相关的机制，我们检测了敲减后相关基因的表达。5.1 实时定量 RT-PCR 法检测敲减后凋亡抑制基因 BCL2 的表达并与阴性对照比 较，分析敲减对 BCL2 的影响。5.2 实时定量 RT-PCR 法检测敲减后细胞周期抑制基因 CDKN1A 的表达并与阴性 对照比较，分析敲减对 CDKN1A 的影响。5.3 实时定量 RT-PCR 法检测敲减后 DNA 合成相关基因 PCNA 的表达并与阴性对 照比较，分析敲减对 PCNA 的影响。5.4 实时定量 RT-PCR 法检测敲减后 D