bdnftrkb活化脊髓星形胶质细胞对神经病理性疼痛的影响word格式论文.docxVIP

2研究方法2.1模型制作鞘内置管大鼠鞘内置管根据Yaksh和Rudy方法进行[15]。大鼠腹腔注射0.04%戊巴比妥钠40 mg/kg 麻醉后，枕骨大孔上方纵向切开约1.5cm切口，钝性分离皮下组织和颈部肌肉，暴露出寰枕膜，用针尖挑破寰枕膜可见清澈脑脊液涌出。将已消毒，一端封闭的充满生理盐水的PE-10导管向尾端插入7cm，至脊髓腰骶段，然后固定导管并缝合伤口。参图1。大鼠清醒后24 h 观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠。用2% 利多卡因10 μl 经导管注射来判断导管的位置，如注射后30 s 内大鼠出现双后肢麻痹现象说明导管位置正确。术后常规腹腔注射青霉素钾20万单位，分笼单独饲养，室温维持20~25℃，自然照明，自由饮水和摄食，5d后即可用于进一步实验。图1.大鼠鞘内置管解剖图5脊神经结扎致神经病理性痛模型的制备参照Kim等[16]方法建立大鼠L神经根结扎(SNL)致神经病理性痛模型。腹腔注射0.04%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，于L4～S2 棘突水平沿背部皮肤作纵向中线切口，切口长约2cm，紧贴棘突骨面钝性分离皮下组织和分离肌肉至L5横突，切断横突暴露内侧L5神经根，用5-0丝线结扎L5神经根，完善止血，缝合皮肤与腱膜，术后常规腹腔注射青霉素钾20万单位，预防术后感染。假手术中仅暴露L5神经但不结扎，其余步骤相同，参图2。图2:L5神经根在大鼠足底感觉支配区域。坐骨神经由部分L4、L5及部分L6 神经根组成，向下延伸走行分为胫神经和腓神经，因此结扎L5神经不影响足底内侧隐神经支配区感觉。箭头所指为机械痛阈测定时vonFrey纤维丝的刺激部位。2.2机械痛阈测定分别于术前1ｄ、术后1、2、4、6、8、10、12、14、16、18ｄ各组取6只大鼠用 vonFrey纤维丝以up-down法推算大鼠的机械缩足痛阈值(PWT)[17]。测定前将大鼠置于有机玻璃箱内适应15min后，用vonFrey纤维丝自金属筛网下部垂直刺激大鼠后肢足底中外侧，持续时间≤4ｓ，大鼠出现缩足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。刺激强度首先从2g开始，当该强度的刺激不能引起阳性反应，则依次增加刺激强度；如出现阳性反应则依次减小刺激强度（0.4g、0.6g、1g、1.4g、2g、 4g、6g、8g、10g、15g）。如此连续进行，直至出现第一次阳性反应和阴性反应，记录两点的刺激强度差值，测定6次，每次刺激间隔30s，最大强度为15g，大于此值时记为15g。按照公式计算机械缩足痛阈值=(10X+kδ)/10,000，其中X为引起大鼠缩足反应的vonFrey纤维丝的刺激强度，k为测定的6次反应中阳性与阴性反应的模式系数（参附录7.3）,δ为vonFrey 纤维丝不同刺激强度之间的平均差（为0.224）。2.3Western-Blot体内实验中，腹腔注射0.04%戊巴比妥钠80mg/kg麻醉后，快速行椎板切除（2 分钟），暴露腰膨大部分，先分离背侧、腹侧部分，在沿中线分出左右。所以的组织放入液氮速冻后存于-80度待用。细胞实验中，直接收集细胞待用。将组织或是细胞用冰冻RIPA裂解液20分钟后，低温离心机4度14,000×g离心10分钟，取上清液，行BCA定量测定蛋白含量后，加入上样缓冲液，加热变性。每孔上样50μg，SDS凝胶电泳，湿转法转入PVDF膜上，5%牛奶封闭，分别加入一抗兔抗大鼠BDNF(1:200)，GFAP(1:500),磷酸化TrkB（1:500）和内参 α-Tubulin (1：1000)4℃孵育过夜，再以二抗辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG(1:5000)室温孵育1h，ECL 显色曝光。用quantity one软件对Western blot条带进行灰度分析，以目标蛋白和α-Tubulin条带灰度的比值代表目的蛋白表达的相对水平。2.4星形胶质细胞培养星胶质细胞培养从出生后2天的大鼠大脑皮层获取。无菌条件下开颅取脑，取两侧大脑半球用冷D-Hanks溶液清洗并仔细剔除脑膜及血管，钳取皮质并充分剪碎（约0.5×0.5×0.5mm大小，尽量细碎）；用抛光后的吸管轻轻吹打，使其成细胞悬液，加入0.125%胰蛋白酶2ml并置于37℃培养箱内消化15min；加入15mlDMEM完全培养基（10%胎牛血清，双抗）终止反应，再次用抛光成口径为1mm的吸管轻轻吹打20次，静止数分钟待组织下沉后，将细胞悬液移入另一新的离心管；再加入15mlDMEM 完全培养基至剩余组织中，抛光吸管稍用力吹打，再让组织下沉，收集细胞悬液；重复上一步骤2-3次，将收集的细胞悬液用200目筛网过滤；过滤后的细胞悬液用50ml离心管分装，1000rpm离心10min；弃上清，用含15%胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮细胞，胎盼蓝染色计数活细胞数量，调整细胞浓度为1×