b.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1c基因的表达word格式论文.docxVIP

南开大学硕士学位论文B.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1C基因的表达姓名：何翔申请学位级别：硕士专业：分子生物学指导教师：陈启要苏云金芽抱杆菌肯尼亚亚种Ag株(B.thuringiensis subsp.J?nyae Ag.简)-.ì称Bt ken-Ag)是一种新型的微生物杀虫剂L 对鳞翅目害虫，尤其是棉铃虫有V良好的毒杀效果，但是还存在一定的缺陷。例如杀虫谱有局限，其发酵效价有待提高，为对其进行遗传改良，本文希望从B.thuringiensis9510中克隆以基阳|入Btk叫试图获得广谱杀虫工程献。本文采用Z♀主丰单从Btken-Ag 中克隆了1.7kb 复制子片段，酶切图谱不同于已发表的B.thuringiensisHD73的复制子片段。在此基础上构建了以pUC19为母体、aph1基因为筛选标记的B.thuringiensis穿梭质粒载体pHV-L质粒pHV-1在E.co/i中可以稳定遗传，经100世代后，质粒保持率在80%以上:在B.thuringiensissubsp.israelensis4Q8中，经100世代后，质粒保持率在20%左右。本文克隆了B./ichen扩brmu热稳定α，淀粉酶基因的启动子和B/huringiensis9510离株的crylC结构基因，并将其插入到质粒载体pHV-1和pHT315中。通过电激转化导入B.thuringiensissubsp.israelensis4Q8中.SDS-聚丙烯戳胶凝胶电泳显示有cryIC基因表达的130kD蛋白带。在B.thuringiensissubsp.israelensis4Q8中还观察到菱形Cry1C毒蛋白晶体。其生物活性有待进一步测定。限制性酶切分析和PCR鉴定发现，克隆的crylC基因与发表的Bthuringiensissubsp.entomociduscη，Cry1C蛋白(-J35kD)小。，1C基因相同，但表达蛋白的分子量比本文为B.thuringiensisf510的遗传背景的研究提供了某些依据和线索。关键词:苏云金芽抱杆菌ken-Ag穿梭质粒载体crylC基因电激转化基因表达zAbstractBaci/lusthuringiensissubsp.kenyaeAgisakindofnewbiopesticides，whichhashightoxicityagainstHeliothisarmigera，butithascertainshortcomings.Forex缸nple，itsspectrumagainstp臼臼isnarrowanditsfermentativetiterislower.S口，也ereisnecessaritytoimproveitsgenetic property.Wehopetoin位oduω也ecrylCgeneintoBtken-Ag，soastoobtainanbroadspectr田ninsecticidal engineeringstrain.Wehavecloneda1.7-kbreplicon fragment from Bt ken-Ag，therestrictionmapofwhichisdifferent企omthereplicon丘。mB.thz。如giensisHD73.On也isbasis，weconstructedashuttlevectorpHV-l，whichusesplasmid pUC19 asp缸entalvectorandaphlgeneasselectivemarker. Plasmid pHV-1canbe inheritedstablyinE.coliafter100generations，themaintenancerateofplasmidpHV-1isabove80%.However，themaintenancerateofitison1y20%orsoinBthuringiensissubsp.israelensis4Q8.Inthisresearch，weclonedthepromoterofthermostablea-缸nylase genefromB.licheniformisandthecrylCstructura1genefromB.thuringiensis9510strain.ThenweinsertedbothofthemintotheplasmidpHV-Iand plasmidpHT315.TherecombinantplasmidswereintroducedintoB.thuringiensissubsp.israelensis4Q8viaelectroporation.ηleSD