MTT实验设计.docVIP

提一个醒:作为一种检测技术,MTT严谨性先天不足,尽量不要作为重要或者关键指标. 1. 试验目的?1.1 对候选化合物进行初步筛选；1.2 了解候选化合物的抗瘤谱；1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。?2. 试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明SRB 染色法、或、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。?3. 评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。附注：评价药物抗癌活性的方法：1. MTT还原法1.1 基本原理：?四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。1.2 操作步骤:1.2.1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培养基配成5000个／ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200μl，37，5％CO2 培养。5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，在前一天下午铺板，次日上午加药.1.2.2 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3～5平行孔，37，5％CO2 培养16-48，倒置显微镜下观察。1.2.3 弃去上清液，每孔加入200 μl新鲜配制的含0.2 mg／ml MTT的无血清培养基．37继续培养4 h。小心弃上清，并加入200 μl DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570 nm，参比波长为450 nm测定光密度值。用其它波长的也有，一般是490nm同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）1.3 结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝(1- OD实验/OD对照) ×100％以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯品的IC50＜10 μg／m1或植物粗提物的IC50＜20 μg／m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。关于如何计算IC50 (1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025(2)Bliss法:自己查阅书籍(3)IC50计算软件 （4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组excel表中可以做两两比较的T-test,这个可以参考一下；数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避