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时间分辨荧光免疫技术 问 题 ★什么是时间分辨荧光免疫分析（TrFIA ）？ ★TrFIA的标记物及特点。 ★为什么叫“时间分辨”? ★TrFIA的检测原理 ★各种免疫方法学的比较 ★ TrFIA的 临床应用 时间分辨荧光免疫 （TrFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay） 定 义 TrFIA分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，当反应体系发生后，用TRF仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。 发展历程 1979年，芬兰SOINI和HEMMIA 提出“时间分辨荧光免疫分析”理论 1983年SOINI和KOJOLA 提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术 现已经成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。 厂 家 芬兰的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研 WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素 镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te) Eu3 +的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术 不同的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自不同的荧光寿命等特点，这样就适合进行双标记和多标记，从而实现可同时检测一个样品中，两种或两种以上的抗原或抗体，即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂盒，这就是我们所说的多标记技术。 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60~900 us) 铕：714us 普通荧光免疫中荧光团：1~100ns 样本中蛋白质荧光：1~10ns，易猝灭。 Stokes位移大 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移近280nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615± 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 时间分辨 生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于400-600nm，所以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。 样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10ns TrFIA技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高，而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6个数量级（1000ns=1us)。 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的时间分辨。 Stokes位移 Stokes位移：是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。 例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm，两者之间的波长差即Stokes位移为273nm（见图2），所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分开。 而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差即Stokes位移为28nm，那就很难排除激发光对发射光的干扰，影响检测结果。 稀土离子激发光、发射光和Stokes位移 解离增强技术 解离增强技术是TRF技术中所特有的 指当免疫反应完成后部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。 再加入低PH值（PH2~3）的增强液，把Eu或Sm从免疫复合物中解离下来，与增强液中的螯合物质（β-二酮体）结合形成新的螯合物，使标记物产生的荧光强度增强近百万倍 时间分辨荧光免疫的原理 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质； 当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特点 （Ⅰ特异性强、 ⅡStokes位移大、 Ⅲ寿命长），并采用解离-增强技术（ Ⅳ DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。 时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolved Fluorescence Immunoassay） 乙肝“两对半” TRFIA定量检测原理示意图 乙肝表面抗原免疫反应图 （