DNA芯片分析技术2003.3硕士班.pptVIP

DNA 芯片技术 复旦大学上海医学院分子生物学实验室 高红阳 021gaohongyang2000@ 第一节 概述 第二节 DNA芯片技术的操作流程 第三节 DNA芯片技术的应用 第一节 概 述 DNA芯片是信息时代的产物，横跨 生命科学 物理学 计算机科学 微电子学 化学 材料科学 DNA芯片是生物芯片（Biochip)的一种 DNA芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片 新型生物芯片 在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面作为固相探针，待测的核酸片段人工标记上不同的荧光色素或同位素、生物素等作为靶片段，一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号，进行计算机分析，从而得到靶片段的基因序列、表达情况等信息。 二. DNA芯片的特点 高度集成化 大通量平行分析 大规模 高灵敏度 样品需要量小 三. DNA芯片的主要类型 原位合成芯片 DNA微集阵列 四. DNA芯片总流程图 第二节 DNA芯片技术的操作流程 一. 芯片的制作 准备 点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布） 固定在芯片上的生物分子样品 固相支持物（即芯片片基） 制作芯片的仪器 1. 固相支持物的种类及预处理 实性材料：玻片、硅片、瓷片 膜性材料：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜 膜结合玻片 原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团 点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸 2. 芯片制备方法 原位合成 适用于：寡核苷酸 原位光刻合成技术 压电打印法 原位光刻合成技术 美国Affymetrix公司专利 每一循环需进行四步反应，若合成含n个核苷酸的寡核苷酸，则需 4×n个化学步骤 合成 4n 个可能序列 压电打印法 类似彩色喷墨打印，但有多个芯片喷 印头及“墨盒”，“墨盒”中装四种碱基 合成试剂，喷印头在整个芯片上移动 其化学原理：固相合成DNA 40~50nt，产率较高 点样法 设计点阵 已克隆的基因片段； PCR、RT/PCR等方法扩增的片段； 人工合成的DNA片段； 带正电荷的尼龙膜或硅片、玻片等 阵列点样机(arrayer) 针式打印（接触式） 喷墨打印（非接触式） 紫外交联固定 点样仪检验指标 点样精度 点样速度 点样密度 样品的均一性 样品是否有交叉污染（清洗） 仪器操作的灵活性、简便性 等等 二. 待检测样品的制备 1. 待检测样品中mRNA 或DNA的提取及纯化 RNA的稳定性 液氮或干冰;立即抽提 RNA 保护剂（注意适用范围） 纯化 2. RT、RT-PCR或PCR扩增（固相PCR系统） 3. 样品的标记 伴随RT or PCR过程 随机引物法、缺口平移法等 标记物 荧光染料，如Cy3、Cy5 生物素、地高辛 放射性核素，如 32P、33P 化学发光 金属离子Au和Ag(纳米金属微粒探针) 双/多色荧光标记 标记产物纯化 三. 分子杂交 芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪 杂交液 清洗液 影响杂交的因素 时间、温度、缓冲液等， 根据芯片上核酸片段的长短、用途选择 杂交条件 基因表达检测 高盐、高样品浓度、低温、长时间（过夜），严谨性较低，有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度 基因突变检测 低盐、高温、短时间（几小时），严谨性高，有利于鉴别出单碱基错配 四. 图像的采集和分析 磷感屏成像系统 荧光芯片扫描仪 图像分析和数据处理软件 第三节 DNA芯片技术的应用 1. 基因表达分析 原理 针对基因的保守区段设计多对完全匹配的寡核苷酸探针（PM）和与之相应的中心单碱基错配的寡核苷酸探针（MM），固定于芯片的相邻位置上，与标记的样品靶序列杂交。正常完全匹配的情况下（阳性），PM的杂交信号明显强于MM的杂交信号，而错配时（假阳性），两者的杂交信号区别不明显，（PM / MM）信号的比值可作为衡量阳性的指标。针对某一基因的三条以上探针呈阳性时，可定性的判定基因的表达。而通过比较正常和异常样品杂交信号的差异，来检测不同样品中基因表达水平的变化。 探针设计原则： 1）探针序列应为特异性强和灵敏度高的寡核苷酸。 2）(G+C)%应在 40~60% 。 3）避免内部“发卡”结构 (连续互补 4 nt）。 4）避免同一碱基的连续出现( 4 nt)。 5）探针与其他已知的各种基因序列进行同源性比较，若此探针序列与非靶基因序列有70%以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用。 6）设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针来检测同一基因。 5. 检测基因突变 原理 根据基因突变热点所有可能的突变情况设计多条