双向凝胶电泳和DIGE技术及其在海洋蛋白质组学研究中的应用.pptVIP

Title or job number 2D DIGE and it’s application in plant proteomics and protein function research 双向电泳—我们可以走的更远 灵敏度 线性动态范围 重复性 定量精确性 质谱兼容与否 EttanTM DIGE 试验流程 Example: 1 colour 2-D Example: 2-D DIGE, internal standard Sample spiking Experimental design: 1 colour 2-D Experimental design: 2-D DIGE Results: BSA 发表文献 Red = unphosphorylatedGreen = phosphorylatedYellow = areas of overlap Decyder软件分析寻找差异表达点 DIGE技术分析蛋白-蛋白相互作用 体外蛋白相互作用检测试验 细胞内p53 HDM2相互作用检测 “Proteomics and Immunological Analysis of a Novel ShrimpAllergen, Pen m 2”The Journal of Immunology 2003 “Proteomics and Immunological Analysis of a Novel ShrimpAllergen, Pen m 2”The Journal of Immunology 2003 寻找与IgE结合的蛋白 确定特异性蛋白为Pen m 2 分离纯化保持酶活性的Pen m 2蛋白 甲壳类精氨酸激酶的交叉反应 研究结果： GE在蛋白质组学中的贡献 EttanTM DIGE 系统组成和优势 消除系统误差 内标设计，更科学的统计学分析软件 Decyder7.0 节省工作量 内标和多重荧光标记 节省工作量至原来的1/6 支持复杂的统计学功能分析 Decyder EDA数据分析模块 同样的在点6，7和8的质谱测试结果，我们也在磷酸化形式的点6和7中检测到特异的磷酸化肽段峰，而在非磷酸化形式的点8中相应的峰不存在。 这个研究思路充分利用了2D技术的高分辨率，直接分离样品中内源磷酸化和非磷酸化蛋白，DIGE的内标和多通道检测技术保证定量的精准，提高了复杂样品中找到磷酸化蛋白的准确性。 体外蛋白相互作用检测试验： 1、表达His-p53和GST-HDM2，亲和层析获得两种蛋白， 2、CY3，CY5分别标记（蛋白与Dye1：1标记） 3、体外相互作用：Buffer中，4度，6h 4、native gel electrophoresis ：4–7% TBE PAGE 5 、Typhoon扫描，观察到蛋白结合体 细胞内p53 HDM2相互作用检测： 1、Hela细胞裂解物分别用Cy2、Cy5标记 2、IP调Cy2- p53-Ab、 Cy5- HDM2-Ab 3、煮沸分离免疫沉淀结合体（证明染料与蛋白的结合耐高温） 4、相互作用反应：Buffer中+4度+6h 10次，恢复生物学活性（瓶颈） 5、Native PAGE（垂直） then IEF（水平） 6、Typhoon 扫描 Western Blot试验验证结合体存在 前景：应用此思路研究Protein-DNA/RNA相互作用 ECL试剂和成像系统（IQ LAS）和定量软件（IQTL） Thank you! Any Questions…. 袁新雨 xinyu.yuan@  sample Design Step 1 Step 2 Step 3 Step n Data Analysis Variation 1 Variation 3 Variation 3 Variation 3 Variation 3 Variation 3 Variation 2 Measuring induced biological change Variation Distribution Variation 1: Induced biological change - what we want to measure Variation 2: Inherent biological variation/individual variation Variation 3: System variation Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Control