《名师伴你行》2012届高考物理一轮复习课件(新课标)2.4 实验(二)：验证力的平行四边形定则.pptVIP

制备包涵体 1、超声破碎细胞 2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体. 3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100 液洗涤2 次 4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体, 包涵体蛋白的变性复性 方法一 在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\L EDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液 剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解 4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀 加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL. 方法二 在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃ 下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解. 4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀 所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL. 检测 取出30 uL 备用 向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃ 沸水处理5～10 m in, 离心后取5 uL 上清上样, SDS检测 相关试剂 Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。30% Triton X-100的配制 试剂 　　Triton X-100 28.2ml 　　0.1mol/L PBS(pH=7.3)或0.05mol/l TBS(pH=7.4) 72.8ml 配制方法 　　取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。DTT中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度99%。DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。