《分子诊断》PCR.ppt

聚合酶链反应及其应用 检验医学院 周 兰 重医医学学士（1979年，临床医学） 重医医学硕士（1986年，病理生理学） 重医医学博士（1994年，临床检验诊断学） 芝加哥大学博后（00-03年，分子肿瘤实验室） 电子邮箱 zhoulan0111@ 本讲内容 1-1 基因扩增及其方式 gene amplification gene magnification 1-1 基因扩增 1）定义：指基因拷贝数增加的现象 是基因表达增加的一种重要机制 一般说来 正常细胞中，特定基因的扩增与其对内外环境因素的应激反应有关 病变细胞中，基因扩增则是致病因素所致的异常扩增,如肿瘤细胞中常见癌基因的扩增 2）方式？？？ 2） 基因扩增的方式 （1）天然扩增机体细胞内的扩增 在各种因素（发育和进化的需要、对环境刺激的应答等）作用下，机体细胞内相关基因的复制扩增 （2）人为扩增 ①分子克隆体外、细胞内 ②DNA合成仪试管内（无细胞体系） ③PCR试管内（无细胞体系） 1-3 PCR的定义 模板DNA 引物（引子序列，一对） 耐热DNA聚合酶 四种单核苷酸 Mg 2+ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 利用DNA聚合酶催化一对引物间的特定DNA片段在体外实现快速、大量扩增的方法 也称：无细胞克隆技术 或：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法 是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新 现已广泛应用到分子生物学研究、临床检测等各个领域。 优点： 特异、敏感、简便 自动化 快速、高效（数小时内可使模板扩增107～108倍） 2-1 DNA的变性和复性 2-2 PCR标准反应体系及反应过程--三步曲 2-3 反应的结果 2-4 PCR的反应条件及其对PCR的影响 2-5 产物片段及其累积过程 2-1 DNA的变性与复性 1）标准反应体系（五要素） （1）DNA模板(template)：靶基因 （2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） （3）催化酶：耐高温的DNA聚合酶（如：Taq酶） （4） 一对引物（primer）：扩增序列的决定者 其与靶基因两侧序列互补 （5） Mg2+ 和 Buffer 高温变性：在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板 低温退火：在低温（37～55℃）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链 适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物的3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链 2-2 反应过程 播放PCR短片 1）每一条双链DNA模板，在一次热循环后就成了 两条双链DNA分子 2）每次循环产生的DNA均能成为下次循环的模板 3）每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物以指数形式（2n）迅速扩增 4）经过25～30个循环后， 理论上可使基因扩增109倍以上 实际上一般可达106～107倍（ why？？？） 式中：Y 表示扩增产物的量 A 表示n-1次扩增时DNA分子数量 E 表示扩增效率 n 表示循环次数 扩增30个循环，即n=30时 若E=100%，则y=230=1073741824(109) 若E=80%，则y=1.8306(107) 由此可见，其扩增的倍数是巨大的! 将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭（EB)等染色，在紫外灯照射下可见到DNA的特异扩增区带 是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出红色荧光 根据情况，可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB；有时亦