免疫学实验课件-病原微生物的快速检测PCR.pptVIP

新鲜，切忌使用反复冻融的材料； 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70℃或-20℃保存； 如要多次提取，请分成多份保存； 液氮长期保存，－70℃短期保存。 II.破碎细胞或包膜 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解； 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量。 III.核酸分离、纯化 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分； 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等； 晾干RNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）； 若长期储存，建议在无水乙醇和1/10体积3M 醋酸钠（pH4.0）溶液中，-70℃保存。 IV.核酸的沉淀、溶解 样品不新鲜； 裂解不充分； 外源RNase污染。 取新鲜细胞或组织，尽量避免样品反复冻融，尽量在低温条件下处理样品； 检查裂解液的质量是否合格，适当增加裂解液用量，延长裂解时间； 严格处理实验中所需的各种耗材和试剂。 问题一： RNA 的降解 。 原 因 对 策 RNA分离的常见问题 蛋白质污染； 酚类污染； 抽提试剂残留。 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够； 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底； 重新抽提一次，再沉淀，溶解； 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 问题二： OD260 /OD280 比值偏低。 原 因 对 策 RNA分离的常见问题 RNA降解； 抽提试剂残留； DNA污染。 操作时注意防止RNA降解； 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇； 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的RNA 。 问题三：下游实验效果不佳。 原 因 对 策 RNA分离的常见问题 四 PCR反应条件设置 温度 时间 循环次数 温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点。 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。 温度与时间的设置 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 温度与时间的设置 退火温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 温度与时间的设置 退火温度与时间 经验公式：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 温度与时间的设置 延伸温度与时间 循环次数的设置 决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 线粒体 细胞色素氧化酶亚基1基因 (Cytochrome C Oxidase Subunit 1, COI, CO1 or COX1) COI序列是最早也是最成熟的真核