免疫学实验课件-酶联免疫吸附试验（ELISA）2015-9-14 窦环上课用.pptVIP

保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。 若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。 室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 Company Logo 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种： （1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。 显色 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。 比色 拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。 酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。 操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。 对照设定 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。 　参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。 标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。 血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，可能会增加非特异性显色。 结果判断 定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应