红细胞膜蛋白提取流程幻灯片.pptVIP

红细胞膜蛋白提取鉴定 内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS.western blotting 鉴定β-actin 实验报告要求： 分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。 实验分组 每个班分三大组，每组十人左右，选出组长 实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS块胶（一个凝胶架） 3.western blot 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量 一.红细胞膜提取制备（低渗法） 原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 －－溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影 “ghost” 注意事项： 1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4?C离心。 （1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4?C）溶血过夜 （以上步骤已完成！！） 溶血液，用“水泵”吸去上清。 ！！：膜很轻 二、 RBC膜纯化（洗涤） RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组） 9000rpm 5’ 沉淀（膜）＋低渗磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打） 9000rpm 5’×4 沉淀 ＋等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟 沉淀（RBC膜）＋0.6ml等渗Buffer （即为RBC原液） 三、 样品处理： 1.SDS用样品处理（一大组）： 0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5’ 2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）： A. 取0.3ml RBC原液＋ 1.5ml H2O＋ 150ul NaOH 沸水浴 5’ 待测管1： 取A液0.1ml＋0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml＋0.7ml H2O 四、Lowry法测定膜蛋白含量 立即摇匀，放置15分钟。以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。 2.红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定 　 　　管号 试剂 １ ２ ３ ４ ５ ６ H2O (ml) 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 标准蛋白 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 __ 碱性铜试剂 １ １ １ １ １ １