_D_半乳糖苷酶酶学性质及制备高纯度低聚半乳糖关键工艺的研究_李海方.pdf

摘 要 β-D-半乳糖苷酶酶学性质及制备高纯度低聚半乳糖关键工艺的研究 学科：工科 专业：食品科学 入学时间：2009 年 9 月 硕士研究生姓名：李海方 答辩时间：2012 年 6 月 指导教师：江波教授 学位授予时间： 低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，它是母乳组成成分之一，具有重要的生理功能， 2008 年国家卫生部批准其为新资源食品，可以应用于食品加工中，因此在食品保健品 行业有重要应用价值。日本和欧洲低聚半乳糖市场需求量非常大，而在我国仍处于起 步阶段。目前,市场上出售的低聚半乳糖浓度大多为 27%~65% ，通常纯化低聚半乳糖 的方法操作复杂，无法完全除去单糖和乳糖，在我国高纯度低聚半乳糖还没有实现工 业化生产。 低聚半乳糖主要是通过 β-D-半乳糖苷酶催化底物乳糖发生转糖苷作用，将糖基转 移到乳糖基上生成低聚半乳糖。本文通过实验室筛选所得菌株马克斯克鲁维酵母 （Kluyveromyces marxianus ）SK 16.001 发酵得到的 β-D-半乳糖苷酶催化乳糖反应生成 低聚半乳糖。同时利用该菌株发酵消耗副产物葡萄糖和半乳糖以及未反应的乳糖，以 此达到纯化的目的。 本文对纯化的 K. marxianus SK 16.001 β-D-半乳糖苷酶的进行研究，该酶具有催化 乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的特性，也具有催化糖基转移生成低聚半乳糖的能力。该 酶水解和转糖苷催化反应最适 pH 相同，但最适温度为 35 ºC 和 40 ºC ，金属离子对其 + + 影响也不同，Na 能够抑制酶的水解作用，K 能够抑制酶的转苷作用。 研究了酶法合成低聚半乳糖的关键工艺参数，通过对四种仪器破碎进行细胞破碎， 比较发现高压细胞破碎仪是实验室破碎酵母最佳仪器，而高压均质机适合工业化生产 应用，但破壁效率不如高压细胞破碎仪。通过单因素和正交试验确定了粗酶液与底物 反应的最佳条件：底物乳糖浓度 400 g/L ，加酶量 1.0U/g 乳糖，反应温度为 40 ºC ，研 + 究发现磷酸钠缓冲液能够促进合成低聚半乳糖，这与 Na 抑制酶向水解方向进行相符。 扩大反应体系至 300 L，反应24 h 以后低聚半乳糖含量可以达到42% 。 通过测定 K. marxianus SK 16.001 生长过程中还原糖变化曲线可知酵母在达到发 酵终点时还原糖完全被消耗掉，而此时酵母仍具有生长能力，因此可以将酵母加入酶 转化得到的普通级低聚半乳糖混合糖液中进行发酵培养。发酵起始糖液浓度为 20% ， 酵母添加量为 15%，反应起始 pH 为 7.0，同时反应过程中对 pH 进行控制，使 pH 保 持在 6.0-7.0 之间，反应 20 h 后，葡萄糖和半乳糖被完全消耗掉，乳糖部分被消耗掉， 聚合度在 3 以上的低聚半乳糖不会被消耗，最终低聚半乳糖占总糖的93.07%，达到纯 化低聚半乳糖的目的。 关键词：β-D-半乳糖苷酶，低聚半乳糖，高纯度，细胞破碎，酶学性质 I Abstract As novel prebiotic, galacto-oligosaccharides(GOS) are functional foods which are approved by Chinese Ministry of Health as new resources foods. GOS are becoming more and more important in food industry. The demand of GOS is very large, especially in Japan and Europe. Currently on the market there’s no high-purity GOS on sale, and the ordinary grade of GOS’s co