细胞培养指南.docVIP

1.1 无菌操作 ① 穿白大褂，戴手套、口罩和帽子，污染时注意及时更换。 ② 离心管、吸管、枪头、EP管和培养容器（瓶、板和皿）等均应高压蒸汽灭菌。 ③ 超净台要用75%的酒精擦拭干净；加样枪、洗耳球和试管架均应用75%的酒精擦拭干净后放入超净台。 ④ 将超净台内的物品摆放整洁后，紫外线照射30min。 ⑤ 相关试剂瓶在放入超净台前，均应用75%酒精擦拭，双手在伸入超净台前也要用酒精擦拭。 ⑥ 超净台内排风扇要开启，酒精灯点燃，所有操作均应在酒精灯前操作，开盖前后瓶口均应过酒精灯，吸管过酒精灯后再放入试剂瓶。 ⑦ 严格禁止袖口在试剂上方擦过，严格避免试剂与废液的污染。 1.2 PBS缓冲液的配制（PH=7.2-7.4） ① 按包装说明，将一袋PBS粉末溶于1L去离子水中，摇匀。 ② 高压蒸汽灭菌后(灭菌后的PBS超过1周后最好重新灭菌)，4℃(室温也可)保存； ③ 标明试剂名称，配制日期，配置人 1.3 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液的配制 ①称取0.25克胰酶蛋白酶和0.02克EDTA，加入100mlPBS缓冲液； ②搅拌混匀，置于 4℃ 内过夜； ③滤器过滤除菌； ④以10ml分装于15ml无菌离心管中，4℃保存(若长期保存，也可放入-20℃)，用前37℃下回温。 ⑤标明试剂名称，浓度，配制日期，配制人。 本实验室购买的是配制好的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液，已过滤除菌，可直接解冻分装使用。 1.4 细胞培养容器的规格 不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 常用的培养器皿 培养器皿 底面积（cm2） 加培养液量(mL) 可获细胞量 96孔培养板 0.32 0.1 1×105 24孔培养板 2 1 5×105 12孔培养板 4.5 2 1×106 6孔培养板 9.6 2.5 2.5×106 4孔培养板 28 5 7×106 3.5cm培养皿 8 3 2.0×106 6cm培养皿 21 5 5.2×106 9cm培养皿 49 10 12.2×106 10cm培养皿 55 10 13.7×106 25ml培养瓶 12.5 2 5×105 (T25)50ml培养瓶 25 5 1×106 (T35)75ml培养瓶 35 10 2×106 (T75)250ml培养瓶 75 15 4×106 (T150)700ml培养瓶 150 40 1×107 注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。 1.5 细胞计数 ① 将牛鲍计数板及盖片用擦镜纸擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 ② 将细胞悬液混匀后吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 ③ 静置3分钟。 ⑤ 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意： 数上不数下，数左不数右； 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 1.6 贴壁细胞换液 ①将培养瓶中原来的培养液弃去。 ②用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次，量以浸没细胞培养面为宜。倒掉PBS。 ③加入新鲜培养基，量一般为培养瓶容积的1/10 ④放入CO2孵箱继续培养。 注意：实验前请将PBS和培养基在孵箱中孵育10-20分钟以复温 1.7 传代培养 对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。 1.7.1悬浮生长细胞传代 离心法传代：300g (1000转/分) 离心5分钟去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 1.7.2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 1.7.3贴壁生长细胞传代 酶消化法传代： ①将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 ②用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次，量以浸没细胞培养面为宜。倒掉PBS。 ③按每1ml/25cm2 标准加入0.25%胰酶溶液(量以浸没细胞培养面为宜)，使瓶底细胞都浸入溶液中。 ④盖上盖子，放在倒置镜下观察细胞。当90%原贴壁的细胞逐渐变亮、变圆时，加入2倍于胰酶体积的血清培养液终止消化。 　　观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。 ⑤用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，吸到15ml离心管中，800rpm离心5分钟去上清。 ⑥取2-3ml培养基将细胞再悬浮，吹打混匀