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基因工程综合大实验实验设计 Iso基因克隆转化大肠杆菌 摘要：将iso合成酶基因，通过puc19，T4连接酶连接到大肠杆菌上，通过AMP抗性的方法筛选出可能的目的菌落，采用PCR进行鉴定。 1目的基因的获得(PCR) 采用CTAB法制备根据已经发表的基因的5′ 端编码区序列和′ 端编码区序列分别设计下列扩增引物5′ GGCGCGCCGGATCCGAATTCCTTCGGGTTCAGACAGGAGCAG G3′（Asc/BamHⅠ/ EcoRⅠ）′ GGCGCGCCGGATCCCTCCGATCTTATCTCTATTGCTCGT 3′ (AscⅠ/BamHⅠ) 引物中存在两个到三个酶切位点 反应体系 工作浓度 PCR扩增程序 Mgcl2 2 ul 1 94℃ 变性 4min dNTPs 1 ul 2 94℃ 变性 30sec 正向引物 1 ul 3 55℃ 退火 30sec, 反向引物 1 ul 4 72℃ 延伸 30sec 至30个循环 TapDNA聚合酶 1 ul 5 72℃ 延伸 10min 模板 1ul 6 10xtaqDNA聚合酶缓冲液 2 ul ddH2O 11 UL 将PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为％，电压60V，电泳时间1左右切胶，将目标带从凝胶中切下来，转入1.5mL离心管中； 加入3倍胶重GS Buffer，将离心管置于50水浴中，使胶融化； 加入1/2 倍体积的PH Buffer混匀后转入离心柱，4离心，10 000rpm，30s； 弃收集管中下清液，加入500μl W2于离心柱中，10 000rpm，离心30s，弃滤液；（重复4操作步骤）将离心柱放回收集管中，最高速离心1min，以弃尽W2； 小心取出离心柱，将其套入一个无菌的1.5ml ep管中，在吸附膜中央加入50μl EB，室温静置2-10min后，最高速离心1min洗脱DNA片段； 取出离心柱，将1.5ml ep管（DNA溶液）置于-20保存备用。solution I ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris.Cl（PH8.0）10mM EDTA (PH8.0) solution II： 0.2M NaOH 1% SDS 使用前现配现用 solution III (100ml)： 5M KAc 60.0m1 冰醋酸 11.5m1 蒸馏水 28.5ml 10mg/mlRNase：称取 100mg Rnase，溶于10ml 10mM Tris.Cl(pH7.5)，15 mM NaCl中，加热煮沸15分钟，冷却后分装成小份，-20冻存。 TE buffer(pH8.0)：10mM Tris.Cl (pH8.0) 1mM EDTA (pH8.0) （2）提取程序 挑取含目的基因的大肠杆菌单菌落，接种于5ml带有相应抗生素的LB液体培养基中，在37℃，250rpm条件下震荡培养过夜；将1.5ml过夜培养物转入微量离心管中，于4℃以12000rpm离心1min弃上清；加入100ul预冷的solution I，涡旋震荡以悬浮沉淀；加入200ul新配制的solution II，盖紧管口，快速颠倒数次，于冰上放置5min；加入150ul冰冷的solution III，轻轻混匀，于冰上放置3-5min；4℃以12000rpm离心5min，将上清转移到另一离心管中；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25v：24v：lv)抽提，混匀后于4℃以12000rpm离心5min，将上清转移到另一离心管中；加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，置室温下10min；于4℃以12000rpm离心5min，弃上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀后，溶于适量的TE buffer，加入1ul 10mg/ml RNAaes，37℃处理1h，重复抽提回收，置-20℃贮存备用 3酶切 根据质粒上的多克隆位点选择BamHⅠ酶进行酶切。 然后进行琼脂糖凝胶电泳，ug的载体DNA和3-5倍等摩尔量的外源DNA；加入1ul 10X T4 DNA Ligase buffer和1 Weiss 单位的 T4 DNA Ligase；加入适量的超纯水，使总体积为10ul；混匀后于16℃连结过夜 5转化和筛选 制备大肠杆菌感受态细胞（参实验书） 热激法转化大肠杆菌 取100μl感受态细胞悬浮液中放到在冰里预冷的薄壁管中，如果是从超低温冰箱取出的感受态细胞悬浮液，则将其放在冰上解冻。 1μl质粒溶液加到上述感受态细胞悬浮液中，轻轻摇匀。然后在冰水浴中放置10~20min.。 薄壁管转入42条件下（如水浴锅）热激90sec。 速将薄壁管转入冰水浴中，放置2min.。 从冰水浴中取出薄壁管，往管中加入ml LB培养基，然后在摇床上37摇