肝素肝素的来源、结构和市场分析（讲稿）.pptVIP

肝素的来源控制、结构与活性的关系、质量趋势及市场分析 姬胜利 博 士 山东大学国家糖工程技术研究中心 教授 河北常山生化药业股份有限公司 总经理 提 纲 1.肝素原料来源的质量控制 2. 肝素的结构与生物活性的关系 3.未来肝素质量标准的发展趋势 4. 肝素全球市场简析 肝素广泛存在于哺乳动物的组织中，如肺、小肠、十二指肠、肝、心、胰脏、胎盘、血液等（目前主要应用猪来源）。 来源主要有猪小肠、牛肺和牛小肠、羊小肠等。 1.1 生猪饲养的健康要求 提取肝素钠的生猪的健康状况，会直接影响到肝素钠的质量，因此必须从肝素钠的源头上，完善生猪饲养的健康要求。 例如在饲养过程中建立生物安全体系、减少致病性病原体的侵入，建立规范的饲养管理操作规程，合理用药、减少不必要的抗生素的使用等。 1.2 粗品肝素钠来源的可追溯性 在肝素钠粗品的制备过程中，原动物组织中的蛋白质、核酸及一些其他糖胺聚糖等成分，不能被完全除尽，而这些残留的杂质常常会有种属特异性。 从饲养到屠宰要有严格的检验检疫报告和生猪档案管理体系，使肝素钠的来源具有可追溯性。 不同动物来源的肝素钠其双糖组成也会有所不同。这些都可以作为追溯粗品肝素钠来源的依据。 1.3 粗品肝素钠来源的检测方法 1. Q-PCR 优点：灵敏、简便、快速 缺点：假阳性、核酸破坏难测出、无法测定精品的来源 2. 双糖组成测定：HPLC 优点：直接测定肝素，准确 缺点：LOD值大，水解物组成复杂，定性困难，过程复杂 3. 13C-NMR 优点：直接测定肝素，准确、快速 缺点：LOD值大，需要特殊仪器 4. ELISA 法 需要测定试剂盒，目前用PAGE电泳测定，如果标记物能通过比色测定，则使用方便 1.3.1 Q-PCR 猪的引物和探针 Sequence of forward primer 5’-CATCACACTGTGTTGGTCATTGC-3’ Sequence of reverse primer 5’-CTCATGGATACCAGTCAGGTTTGT-3’ Sequence of probe (reverse) 5’-(6-Fam)CACTGAGACACAACAGGAACTCCGCC(BHQ1)-3’ Q-PCR 牛的引物和探针: Sequence of forward primer 5’-CGGAAACGACTGAAACGACTTC-3’ Sequence of reverse primer 5’-GTGTGATCCTACCTGACTGTTCTAA-3’ Sequence of probe (forward) 5’-(6-Fam)CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(BHQ1)-3’ Q-PCR 绵羊的引物和探针: Sequence of forward primer 5’-GATTCCTCTCGCATCCATGCAG-3’ Sequence of reverse primer 5’-GGTCCAAGTCAGCACTGGAG-3’ Sequence of probe (forward) 5’-(6-Fam)TGGAGTCGG+G+CCCG(BHQ1)-3’ Q-PCR 山羊的引物和探针 Sequence of forward primer 5’-GTAACGCCCTCCAAATCAATAAGA-3’ Sequence of reverse primer 5’-GGTCAACATGGCTTAGTCAAACTT-3’ Sequence of probe (forward) 5’-(6-Fam)AGGAGCAGGTATCAAGCACACATCTCGT(BHQ1)-3’ Working LOD bovine: 7 pg per mg of crude heparin Working LOD ovine: 70 pg per mg of crude heparin Working LOD caprine: 4 ng per mg of crude heparin 1.3.2 SAX-HPLC测定双糖组成 1. 用肝素酶I、II、III将肝素降解 2. 用SAX-HPLC测定双糖含量组成，232nm检测 1.3.4 ELISA测定 牛粗品肝素含有Ag1抗原，它是抑肽酶-肝素复合物，对温度、pH、化学处理等都很稳定，可以作为免疫化学法检测肝素钠粗品牛来源的靶点。 将粗品肝素注射给家兔，产生抗体，然后利用ELISA测定是否含有牛肝素。 检测限5ppm 同样原理用于测定绵羊肝素和山羊肝素 检测限是