[医学]2012生化-3-核酸.pptVIP

第三章核酸化学Nucleic Acid 1953年, Watson Crick DNA双螺旋模型 核苷酸可进一步磷酸化生成核苷二磷酸及核苷三磷酸 AMP进一步磷酸化生成ADP及ATP 7 6 40 5 DNA → 核小体 → 螺线管 → 超螺线管 → 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 　 400nm　 　 2~10μm 一级包装 二级 三级 四级 2. RNA的结构 6). tRNA的二级结构 三类RNA比较： 　rRNA　含量最高 　tRNA　分子量最低　稀有碱基最多 　mRNA　寿命最短 二. 性质 分子杂交 5 降解 *pGATCGGACCT 2. Sanger酶法(末端终止法) a. 5′ -帽子 (甲基化的鸟苷酸, p268) b. 3′-尾巴(多聚腺苷酸, polyA) c. 5′-端、3′-端含长度不等的非编码区 真核生物mRNA的结构特点 4). mRNA AUG UGA UAG UAA Cap PolyA 翻译区 非翻译区 非翻译区 起始密码 终止密码 5). rRNA 1965年, Holley提出三叶草模型 a. 由76~95个核苷酸组成 b. 四环+四臂 c. 氨基酸臂(5′-pG, 3′-CCAOH) d. 反密码环含反密码子(由三个核苷酸组成) e. D环含二氢尿嘧啶(D) f. TψC环含TψC序列 g. 可变环上核苷酸数目变化较大(分类依据) h. 含较多的稀有碱基 tRNA的三级结构(倒L型) 7. 其它RNA 不均一(hnRNA)　　小分子(snRNA) 反义(asRNA)　　　 核酶(ribozyme)　　　　　　　　　　　 1. 一般性质 a. DNA白色纤维状固体(丝状), 黏度大 　RNA白色无定形粉末, 黏度相对较DNA小 b. 溶于水, 不溶于乙醇、氯仿 2. 两性电解质, 酸性较强(pI3) 既含碱基, 又含磷酸基, 为两性电解质 可电泳、离子交换层析(分离纯化) Ion-exchange chromatography Column + anions + + + Sample mixture Protein binding Column + proteins Column + anions Ion displacing Purified protein 3. 紫外吸收 碱基环平面共轭, 对紫外光强烈吸收(230-290nm) λm=260nm 增色效应 天然DNA 260nm的光吸收值小于各核苷酸总的光吸收值 应用 定位核酸在细胞和组织中的分布 定性定量(核酸或核苷酸) 4. 变性、复性和分子杂交 变性 有序的二、三级结构转变成无序的结构, 　　 但一级结构不变 特征 生物活性部分丧失, 黏度下降, 浮力密度升高, 紫外吸收增加(增色效应) 因素 加热、酸、碱、搅、振、有机物(脲甲醛) 热变性 缓慢加热DNA变性 DNA的变性是爆发式的,在很窄的温度区间内完成, 通常将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称为熔解温度, 用Tm表示 DNA的Tm值一般在70-85?C之间 影响Tm值的因素 a. G-C对含量: G-C含量高, Tm值高 （G+C)%=(Tm-69.3)×2.44 b. 溶液的离子强度: I高, Tm高 c. 溶液pH值: pH8.3稳定 d. 变性剂: 破坏氢键 复性 变性核酸的互补链在适当条件下, 重新缔合成双螺旋结构的过程 复性时, 单链随机碰撞, 不能或只能形成局部碱基配对, 在较高的温度下, 两链重又分离, 经多次试探性碰撞才能形成正确的互补区, 故复性温度不能太低, 一般以(Tm-25℃)较适宜 片段浓度(高, 快) 片段大小(小, 快) 片段重复序列(多, 快) 溶液离子强度 影响复性的因素 在退火条件下, 不同来源的DNA互补区形成双链, 或单链DNA和单链RNA的互补区形成DNA -RNA杂合双链的过程称分子杂交 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义 Southern bolting: DNA-DNA Northern bolting: DNA-RNA Western bolting: Pr-Pr 原位杂交: 探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交 变性DNA与*RNA 温育 除去未