[农学]2 基因工程.ppt

第一节 基因工程的含义（genetic engineering） 一、基因工程的含义 在自然力量以及人的干预下， 通过基因重组、基因突变、基因转移等途径， 推动生物界的进化，不断使物种趋向完善， 出现了今天各具特色的种类繁多的物种， （耐高温、耐寒、耐旱、耐盐等） 种种生物的特殊性状 成为今天定向改造生物、创造新物种的丰富遗传资源。 基因工程的含义 （基因操作、遗传工程、DNA重组技术） 按照人们的愿望，进行严密的设计， 通过体外DNA重组和转基因等技术， 有目的地改造生物种性， 创造出符合人们需求的生物新类型或基因产物， 或者利用这种技术对人类疾病进行基因治疗等。 基因工程最突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、 动物与植物之间、 甚至人与其他生物之间的 遗传信息进行相互重组和转移。 人的基因可以转移到大肠杆菌中表达， 细菌的基因可以转移到动植物中表达。 基因工程操作基本技术路线 2. 利用PCR扩增目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列， 可以通过合成1对与模板DNA互补的引物， 可利用PCR扩增目的基因。 3. 化学合成目的基因 4. 通过构建基因组文库或cDNA基因文库分离目的基因 基因组文库 把某种生物基因组的全部遗传信息 通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中， 这个群体即为这种生物的基因组文库。 cDNA文库 某种生物基因组转录的全部mRNA 经反转录产生的各种 cDNA片段分别与克隆载体重组， 贮存在一种受体菌克隆子群体之中， 这样的群体称为cDNA文库， cDNA文库 较高等的生物在特定发育阶段或特定器官表达的基因有所不同（基因的时空表达）， 所以用特定发育阶段或特定器官的材料构建的cDNA文库 通常是部分 cDNA文库。 cDNA文库的一个克隆子包含一个基因的全部编码序列， 不含内含子、转录启动子和终止子的核苷酸序列， 所以使用从cDNA文库中获得的目的基因时， 在其两侧必须组装上转录启动子和终止子等元件。 从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因 根据目的基因已知的核苷酸序列制备核酸探针， 对基因组文库或cDNA文库 的一系列克隆子的DNA分子进行杂交， 能杂交的克隆子就含有目的基因（阳性克隆子）。 最直接的方法 3）具有某些供选择转化子的标记基因 如：氨苄青霉素抗性基因(apr或ampr)、氯霉素抗性基因(cmr)、 卡那霉素抗性基因(kmr或kanr)、链霉素抗性基因(smr)、 四环素抗性基因(tcr或tetr)等， 蓝白筛选(β-半乳糖苷酶基因)， 报告基因：gus (β-葡萄糖苷酸酶 )、 gfp (绿色荧光蛋白基因)等。 4）克隆载体必须是安全的 不应含有对受体细胞有害的基因， 并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞， 尤其是人的细胞。 重组DNA分子只有进入适宜的受体细胞后 才能进行大量的扩增和有效的表达。 原核生物细胞和真核生物细胞可作为受体细胞， 但不是所有细胞都可以作为受体细胞。 选择受体细胞 1）便于重组DNA分子的导入； 2）便于筛选克隆子； 3）重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持； 4）对遗传密码的应用上无明显偏倚性； 5）遗传稳定，易于扩大培养或发酵。 大肠杆菌感受态细胞 感受态 指受体（如大肠杆菌）最易接受外源DNA片段 并实现其转化的一种生理状态。 一般出现在对数生长期， 每毫升培养液的细胞数在5×107个左右为佳。 （OD600为0.4-0.6） 用CaCl2处理，增大细胞膜的透性，诱导产生感受态细胞。 1）接种单菌落于3ml LB液体培养基中， 37℃振荡培养12h左右（过夜）； 2）将该菌悬液以1：100转接于100ml LB液体培养基中， 37℃振荡扩大培养至OD600值0.4-0.6； 3）取培养液1.5ml转入 Eppendorf 管中，在冰上冷却10min， 4℃，5000r／min，离心5min 。 （从这一步开始，所有操作均在冰上进行） 4）去上清培养液，用0.5ml 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；4℃，5000r／min离心5min； 5）去上清，加入200μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 6）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验， 也可加入