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微生物发酵法制备壳聚糖 摘要：本文综述了运用微生物法生产壳聚糖，主要介绍了用黑曲霉、雅致放射毛酶、米根霉发酵生产壳聚糖的方法和过程。 关键词：壳聚糖 黑曲霉 雅致放射毛酶 米根霉发酵 前 言 壳聚糖(Chitosan)即脱乙酰甲壳质,系统名称为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-B-D-葡聚糖,是自然界中存在的唯一一种碱性同聚高分子多糖物质。壳聚糖由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物相容性和成膜性等优良特性,已在化工、食品、化妆品、环保、医药、农业等方面得到广泛应用。尤其近年发现低分子质量壳聚糖及其降解物具有抗肿瘤、抗菌、激活免疫及保湿等特性,在医疗领域具有广阔的应用前景。目前工业化生产的壳聚糖主要是采用虾、蟹的外壳作为原材料,但原料来源受季节和产地的影响,且易造成环境的污染。近年来国内外从真菌中提取甲壳素/壳聚糖的研究已悄然兴起。20世纪80年代,日本、美国先后开始对微生物发酵生产壳聚糖进行研究,90年代初我国也开始涉足这方面研究,与传统的虾、蟹壳作原材料相比,从真菌细胞壁中提取壳聚糖有很多优点,真菌可通过工业发酵大规模培养,不受原料、季节、地域等方面限制,产品质量和产量易于控制,生产工艺简单,周期短,动力消耗和环境污染小,而且对生产过程中的废弃菌丝体进行处理提取壳聚糖,可变废为宝加强废弃物的综合利用,提高经济效益和社会效益。 甲壳素是绝大数真菌细胞壁的主要组成成分，只有少数真菌的细胞壁不含甲壳素。甲壳素处于真菌细胞壁的内层部位，临近质膜，是真菌菌丝尖端延长部位的主要组分，甲壳素的生成与真菌菌丝的生长有密切关系。真菌中的甲壳素是a-甲壳素。甲壳素分子链所形成的纤维可长达几个微米。许多制药和酶制剂的发酵过程产生的下脚料中含有真菌菌丝体，可以从中提取甲壳素，如下文中介绍的从柠檬酸发酵废渣中欧冠呢提取甲壳素那样，此外还可以冲青霉素、链霉素等发酵废液中滤除菌丝体提取甲壳素。 一、黑曲霉发酵生产壳聚糖 实验室制备菌丝体： 1、菌种斜面培养基：土豆培养基:马铃薯20%,蔗糖2%,琼脂2%,pH自然。121℃灭菌20min。 2、4种培养液 （1）查氏培养液：蔗糖3%,NaNO3 0.2%,K2HPO4 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4 0.001%,KCl 0.05%,pH7.2-7.4。 (2) 沙氏(Sabourand)培养液:葡萄糖4%,蛋白胨2%,pH自然。 (3)YEPD培养液:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸出汁1%,pH6.0。 以上培养液均经121e灭菌20min后使用。 (4) 葡萄糖一玉米浆培养液;蔗糖一玉米浆培养液。 图一、黑曲霉在察氏培养基，沙氏培养基，PEDA培养基的生长情况 3、甲壳素的提取 方法一、稀碱液（1%-2%）分解制备甲壳素。 方法二、在稀碱液中电解：称取40g湿菌体于电解装置的1000ml烧杯中，加入 一定量、一定浓度的 N a O H 溶液，搅拌混匀后，将反应装置放入20℃水浴中，在一定的电压(直流恒压)下进行电解，同时进行搅拌。电解结束后，3000r/min 离心15min 得沉淀，再将沉淀离心洗涤至中性。 4、甲壳素脱乙酰化制备壳聚糖 方法一、浓碱法脱乙酰化： 在电解所得的电解产物中加入 300ml50%的NaOH溶液，140℃油浴中恒温反应 4h，反应过程中进行搅拌，反应结束后，将反应产物离心洗涤至中性。 方法二、微波脱乙酰化： 20%氢氧化钠溶液,在一定微波火力下,处理一定时间后,离心洗涤沉淀至上清液呈中性。 除了实验室制备菌丝体外，柠檬酸废渣是获取黑曲霉菌丝体最廉价的原料。 二、丝状真菌-雅致放射毛酶发酵生产壳聚糖 丝状真菌细胞中存在着甲壳素合成酶和甲壳素脱乙酰酶，具有自身的催化作用，能把细胞内容物UDP(尿苷二磷酸)-N-乙酰葡萄糖胺转变成壳聚糖。 1、培养基灭菌，菌种发酵 培养液的ph会直接影响到生产壳聚糖的脱乙酰度，当控制ph在7.4~7.6时，可获得脱乙酰度为85%~90%的壳聚糖。 2、壳聚糖的提取 菌种培养后取菌丝充分冲洗干净烘干称重,先用稀碱加热脱蛋白,再用稀酸处理提取壳聚糖。 用丝状真菌培养法生产壳聚糖是一种无毒害、无污染、提取工艺简单、便于生产的好方法,大有发展前途。 三、米根霉 米根霉是生产L-乳酸等发酵产品的菌种，用发酵废渣提取壳聚糖也是废物利用的好方法。 用米根霉发酵制备壳聚糖的步骤 菌丝体处理→菌丝体粉碎→稀碱除蛋白核酸→收集滤渣洗至中性→3%双氧水脱色→30%浓碱液脱乙酰→抽滤，水洗滤渣至中性→5%醋酸提取→过滤，滤液调ph为11→离心收集沉淀→乙醇洗涤沉淀→真空干燥