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荧光寿命成像及应用深圳大学光电工程学院第三小组：豆秀婕、王昱鑫、乔文、王凯团队分工豆秀婕王昱鑫乔文王凯荧光寿命成像原理及测量方法 荧光探针荧光寿命的应用. 荧光寿命的应用及展望.目录荧光寿命成像的原理. 荧光寿命的定义荧光寿命的测量方法. 荧光寿命成像技术简介 荧光寿命成像显微(FLIM)技术将荧光显微与时间分辨荧光测量技术相结合,通过逐点测量样品的荧光寿命,提供细胞或组织样品荧光寿命的空间分布。 荧光光谱技术和荧光显微技术可揭示样品中荧光团的组分和分布.但以往荧光分析或成像技术大多基于荧光强度的测量,容易受激发光强度、样品猝灭和荧光染料的分布浓度等许多因素的影响,因此难以做到定量测量. 荧光寿命的测量一般来说是绝对的,不受激发光强度变化、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响,且不受其他限制强度测量因素的制约,仅与荧光团所处的微环境密切相关。因此,通过对样品进行荧光寿命成像(FLIM),可以对分子所处微环境中的许多生物物理、生物化学参数如pH值、离子浓度、氧压、溶液疏水性及猝灭剂等的分布进行定量测量。 荧光寿命的定义?荧光寿命——荧光分子在吸收激发光子后,基态的电子就会跃迁到高能级,经过短暂豫振动后,电子积累在态。然后电子会通过各种途径跃迁到基态,其跃迁速率与态上积累的电子数量呈正比。 荧光寿命的定义? 假定一个无限窄的脉冲光激发个荧光分子到激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和，则激发态衰减速率可表示为=-(Γ+ )n(t)可得到激发态物种的单指数衰减方程 n(t)= exp荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为: I(t)= exp荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: τ=(Γ+)-1 也就是说荧光强度衰减到初始强度的时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。荧光强度衰减曲线 荧光寿命的测量方法 时域法是用超短光脉冲激发样品,然后测量样品在受到光激发后不同时刻所发出的荧光的强度,最后根据荧光强度的衰减规律来分析并计算荧光寿命值。在频域法中,用强度按正弦调制的激光激发样品,荧光的强度也是按正弦调制的.二者调制频率相同,通过测量荧光相对于激发光的相移及解调系数计算荧光寿命值。荧光寿命的测量方法主要有时域法和频域法时域法测量原理 根据所测得的样品中各点的荧光强度衰减曲线来拟合分析并计算荧光寿命值。 一种简单的情况是单组分荧光寿命的测量,这时只需在样品受到脉冲光激发后两个不同时刻分别测量荧光强度的衰减时域法荧光寿命成像的原理图. 时域法测量01.门控探测法(time-gated detection) 02.时间相关单光子计数法(time correlated single photoncounting , TCSPC) 03.扫描相机测量法(streak-FLIM) 时域法荧光寿命的测量和荧光寿命成像门控法测量 生物荧光寿命成像装置通常由激发光源、光电探测器成像器件)、延迟装置及图像处理设备组成。 门控装置的光源通常为短脉宽超快激光器，CCD是常见的成像设备，延迟装置提供FLIM的控制信号，荧光寿命可通过在两个不同延迟时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得。 光电探测器及CCD等成像器件输出的都是光强度信息,需要利用强度信息图像反演出荧光寿命图像。 典型门控荧光寿命成像系统框图 门控探测法 门控探测法适于单组分荧光强度衰减的测量和荧光寿命成像，通过延时电路以及选通时间窗口获取两幅不同时刻的强度图像，最后通过荧光光强单指数衰减的公式，计算出荧光寿命。门控探测示意如图： 时间相关单光子计数法TCSPC 时间相关单光子计数法测量荧光寿命通过大量测量样品在受到脉冲光激发后荧光光子到达探测器的时间,从而得到荧光强度的衰减规律。TCSPC 的工作原理如图1: 时间相关单光子计数法 以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图, 此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。 扫描相机测量法 扫描相机是一种具有极高时间分辨率和灵敏度的探测器,它可以获取一维空间或光谱的时间分辨信息 扫描相机测量法 该系统由皮秒二极管激光器、荧光显微镜、扫描相机、扫描振镜系统以及计算机等组成。 用三角波驱动X方向扫描振镜Gx,对从皮秒脉冲激光器输出的光脉冲进行线扫描,并通过与奥林巴斯显微镜耦合的中间光学系统,将线扫描光束聚焦到样品上对样品进行激发,样品所发出的荧光被显微物镜收集,透过双色镜后成像到扫描相机的光电阴极上。 用步进扫描信号驱动Y方向扫描振镜Gy,对样品进行扫描方向垂直于Gx的步进线扫描,以获得对整个样品的测量和成像。扫描相机对一维的荧光信号进行时间分辨,最后通过CCD保存到计算机里,通过Gy的步进扫描以及图像处理软件,就可以得到细胞的荧光寿命图像。 频域法测量 频域法是用强度按正弦