[生物学]基因工程常用分子生物学技术.pptVIP

第二章 基因工程常用分子生物学技术 第一节 凝胶电泳技术 一、电泳的原理 二、琼脂糖凝胶电泳 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 探针技术 一、核酸探针 1. 双链DNA探针 ⑴ 切口平移法 2. 单链DNA探针 ⑵ 从RNA合成单链cDNA探针 3、寡核苷酸探针 4、RNA探针 RNA探针的优点： 二、非核苷酸探针 第三节 核酸分子杂交技术 一、萨瑟恩DNA印迹杂交 步骤： 二、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 三、菌落杂交 四、ELISA 第四节 PCR技术 一、PCR技术的原理 二、PCR反应中的几种成分 1、Taq DNA聚合酶 2、关于PCR引物 3、用于PCR扩增的模板 4、用于PCR扩增的dNTP 第五节 DNA序列测定 一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 （一）原理 （二）步骤 三、DNA大片段的连续测序 四、DNA序列分析的自动化 第六节 寡核苷酸片段固相合成 一、用于寡核苷酸化学合成的单体 二、寡核苷酸片段合成的步骤 第七节 分子标记技术 二、RAPD技术 （一）RAPD的基本概念和原理 (三)RAPD的基本实验程序 三、AFLP 四、SSR技术 五、 mRNA差异显示反转录PCR 技术 1976年，Chien.A从一种生活在温度高达75℃的热泉的细菌（即栖热水生菌，Thermus Aquaticus）中分离纯化出了一种耐高温的DNA聚合酶，现命名为TaqDNA聚合酶。这种酶经95℃持续温育仍有活性，因此在DNA变性加热的温度下不会失活，故无需在每轮反应中补加新酶。 TaqDNA聚合酶与Klenow大片段相比，缺少3′→5′的外切核酸功能，但具有5′→3′的外切核酸酶功能，故Taq酶缺少校对活性。 Rappolee指出引物设计需要根据以下原则： （1）引物应是DNA序列的一段高保守区； （2）引物3′端的保守序列很重要，并要求非简并性密码，密码的第三个碱基不应摇摆； （3）引物3′端不能互补，不能具有反转重复序列，避免形成引物二聚体； （4）引物的设计应避免形成二级结构； （5）避免引物中G/C和A/T富聚区的不平衡分布，但允许有OligodT和polydC； （6）引物是特异性的，不能与其它基因的序列同源； （7）根据实验设计要求可以在引物5′端进行特殊设计，即加入几个碱基以便在扩增产物中创造一个限制性酶切位点，或一个GC box，或一个启动子。较长的引物-模板杂合体的Tm值较高，因此在PCR的最初几次循环之后需要适当增加融合温度； （8）为了进行未知序列的扩增，需要对引物进行特殊设计。 单链、双链DNA以及通过逆转录的cDNA都可以作为PCR反应的模板。无论哪种DNA，都要具有较高的纯度。模板DNA的用量，依DNA的性质而定。 PCR扩增使用的dNTP的浓度一般为50～200μmol/L。对于典型的PCR扩增反应，一般要求四种dNTP的浓度相等。 用于PCR的标准缓冲液中含有：50mmol/LKCL、10mmol/L Tris·Cl（pH8.3，于室温)和1.5mmol/L MgCl2。其中Mg2+对PCR反应的成败起着关键作用。镁离子的最佳作用浓度相当低（1.5mmol/L）。 5、用于PCR的缓冲液 PCR反应管中往往要加入适当的灭菌矿物油，以防止反应液在高温下的蒸发并减少污染。但矿物油的用量一定要适当，太少起不到应有的作用，太多又会降低热循环效率，一般是在100ul反应体积中加70ul，50ul体积加40ul，25ul反应体积加30ul。 6、矿物油 7、循环次数 分析性PCR的最适循环次数是25～35次，即使微量的PCR产物也能用琼脂糖凝胶电泳检测，而制备性PCR是循环次数不能超过40次。循环次数太多是不利的，会使非特异性扩增产物增加。 这种方法利用DNA聚合酶的两个性质： （1）在有单链模板、引物，带有3′-OH末端的引物，4种dNTP存在时，DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，按照碱基互补配对原则，不断将dNTP加到引物3′-OH末端，合成出与单链模板互补的新链。 （2）DNA聚合酶还可以ddNTP（2′,3′-双脱氧核苷酸）作为底物，使之掺入到正在延伸的DNA链中，但是由于ddNTP缺少3′-OH，无法和下一个核苷酸之间形成3′，5′-磷酸二酯键，所以在ddNTP掺入的位置，链延长终止。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）和双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的分子结构式 Sanger双脱氧链终止DNA序列分析法原理 C T G A C T T C G A C A A T G T T d