[生物学]完整cDNA序列技术.pptVIP

完整cDNA序列获取技术 指导老师：刘若余 专业：动物遗传繁殖与育种 学生：彭邦星 cDNA的定义 RACE发展简史 RACE的原理 RACE的改进 具体步骤和前景  cDNA定义：cDNA是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。 因为基因上并不是全部都表达的DNA片段，比如内含子，在基因转录的时候是要一段全都转录的，这就需要将转录来的mRNA中不需要的部分切除，然后再拼接。也就是说用RNA逆转录出来的DNA单链是比原来的短的，这个纯粹有基因表达序列的DNA这个就是cDNA。 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)：是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 发展简史 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术.二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。 R A C E 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA顺 序来扩增出完整的c D N A 3’ 和5’ 端的方法, 又被称为单边PC R (one- sided PCR )和锚定PCR (an-ehored PCR )。 RACE原理： 3 ‘一RACE (的一般过程是: 以多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸oligo (dT )1 7 和在许多文章中被称为锚引物(anch or Prim er )或接头(adaPtor ) 的序列组成的引物QT 逆转录mRNA 得到第一条cDNA 链, 然后用含部分锚引物序引物Q。与基因特异性引物G SP I 进行第一轮扩增得到双链cDNA , 第二轮扩增则采用内部引物 (nested p rim e r ) Q1 和GSP Z , 以防止产生非特异性扩增产物。 采用同样的原理可以进行5‘ 一R A C E 。先用基因特异性引物GSP 一RT 逆转录m R N A 获得C DN A 第一条链, 然后用末端脱氧核昔酞转移酶(T d T ) 和dAT P 在cD N A 5‘ 端加上p o ly(A ) 尾; 再使用(l) QT 引物合成c D N A 第二条链, (2 )Q。和一个在G S P- R T 上游的引物G S P I 扩增c D N A ; 最后采用内部引物Ql 和G S P Z 进行第二轮P C R 扩增以提高特异性。扩增后得到的双链c D N A 用限制性内切酶酶切和So ut her n 杂交分析并克隆, 得到51 特异性和31特异性的c D N A 文库。从两个有相互重叠顺序的5 ‘和3 ‘ R ACE 产物中可以获得全长 c DNA , 或者可以分析5 ‘ 和3’ 端顺序, 合成相应引物扩增出全长c DNA。 对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3‘端引入两个简并的核苷酸 【5’-Oligo(dT)16_30MN-3‘, M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在母链5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端