免疫学检测技术的基本原理-免疫学课件演示幻灯片.pptVIP

湖北理工学院精品课程;第二十二章 免疫学检测技术的基本原理;第一节 抗原或抗体的体外检测;2、抗原-抗体反应的可逆性 非共价键结合的抗原-抗体复合物不稳定，降低溶液的pH值或提高溶液的离子强度，可使抗原-抗体复合物离解（即具可逆性）。 3、抗原-抗体反应的可见性 抗原与抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于二者的比例和浓度。 4、抗原-抗体反应的阶段性 分为两个阶段，第一个是抗原-抗体特异性结合阶段，其特点是反应快，一般不能为肉眼可见；第二阶段为反应可见阶段，根据参加反应的抗原物理状态的不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象，其特点是所需时间长，且受电解质、温度和酸碱度等因素的影响。;二、抗原-抗体反应的影响因素 1.电解质 抗原和抗体在中性和弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝聚团块或沉淀物。抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。 2.温度 较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。常用37℃水浴保温。 3.酸碱度 血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。;三、抗原-抗体反应类型和检测方法 （一）凝集反应：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下（电解质、pH、温度等）出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。 根据抗原的性质分为直接凝集试验和间接凝集试验。 1.直接凝集试验颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的称作直接凝集试验。按操作方法可分玻片法和试管法两种。 （1）玻片法 为一种定性试验。将含有已知抗体的诊断血清与待检抗原悬液在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。 此法简便快速，适用于新分细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定。也可用已知的诊断抗原，检测待检血清中的相应抗体，如ABO血型鉴定。;伤寒杆菌免疫血清 伤寒杆菌免疫血清 生理盐水（NS） + + + 大肠埃希菌 伤寒沙门菌 伤寒沙门菌 阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。 阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。;不凝集（-） 凝集（+） ;（2）试管法 为一种定量试验，用以检测血清抗体含量。以协助疾病的诊断，如肥大反应、外斐反应等 。 将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37℃水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为++++(100％凝集)、+++(75％凝集)、++(50％凝集)、+(25％凝集)和-(不凝集)。以其++以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价(或称滴度)。 试验时必须设置阳性血清、阴性血清和生理盐水等对照。;（二）沉淀试验 可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的白色沉淀物称为沉淀反应(precipitation)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。 1.环状沉淀试验 在内径为2-3mm的小试管底部先加入已知抗血清，然后沿试管壁缓缓加入已适当稀释的待测抗原于血清层上，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。用于法医的血迹鉴定、昆虫吸血性测定、炭疽病的诊断等。 ;2.琼脂扩散试验 琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。 用琼脂制成固体的凝胶，使抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇形成肉眼可见的沉淀物，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，称为琼脂扩散。;双向双扩散：即用1％琼脂浇成厚2-3mm的凝胶板，在其上打圆孔，是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。 用8% Nacl溶液制1%琼脂糖平板，打孔（孔径6 mm周边与中心孔距3 mm）。;3.对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 原理 抗原在碱性溶液(pH8．2)中带负电荷，在电场中向正极移动，而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极泳动。将抗体置正极端，抗原置负极端，电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带。 琼脂凝胶制备 选用优质琼脂（或琼脂糖），浓度为