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第十六章 基因诊断与基因治疗 Gene diagnosis and gene therapy 用途——诊断下列两种类型疾病： 1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵 基因结构的异常 基因致病 基因表达的异常 第一节 基因诊断 一、基因诊断的特点： 1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。 2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的灵敏度。 3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。 二、基因诊断的内容和技术 直接诊断___致病基因明确 间接诊断___致病基因不明确， 基因连锁分析 分子基础——基因结构异常 基因表达异常 基因诊断的常用技术类型 （1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR） 单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术 针对不同突变类型的基因诊断技术 1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP 杂交的结果： （Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突变基因纯合子 （Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变 2、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断 方法同点突变的诊断 镰状细胞贫血病（sickle cell aneamia） ?C地中海贫血 ?珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb （二）血友病A factor VIII 基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等） 基因产物凝血因子VIII 无活性或不稳定，导致凝血障碍。 PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 Bcl I 限制酶 酶切位点在 基因内18号外显子3′端 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断 四、 肿瘤的基因诊断 一)肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤标记基因或mRNA 2、检测肿瘤相关基因 3、检测肿瘤相关病毒基因 五、感染性疾病的基因诊断 目前应用最多是PCR法，不仅可检测病原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病毒、丙肝病毒等）。 应用范围 1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜 在感染的发现； 3.大规模病原流行病学的现场筛查 4. 病原体抗药性的快速敏感试验; 5.对微生物的科属种进行准确分类 鉴定; 。 六 基因诊断在法医学中的应用 PCR结合DNA指纹技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 第二节 基因治疗Gene therapy 基因治疗的概念 基因治疗是指把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。 一、基因治疗的必要条件 （1）用传统治疗无效或效果不佳； （2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，； （3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留； （4）导入基因能有适度表达； （5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害； （6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制； （7）人类的基因治疗需经过严格审批 二、基因治疗的主要策略 （一）基因修复或基因矫正  矫正突变碱基，精确的原位修复 最理想，难以实现 (二)基因置换 指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组） （三）基因增补 1、概念 通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不表达的基因。 2、基因添加的两种类型 （1）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因 （2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因 （四）基因干预 采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达 1.反义核酸技术 2.核酶 3.RNA干