第3章 蛋白质通性、纯化和表征.pptVIP

第3章 蛋白质通性、纯化和表征;（一）蛋白质的两性电离 ;蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 　　当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。;蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 在等电点偏酸性溶液中，蛋白质分子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质分子带负电荷，向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳。;自由界面电泳:蛋白质溶于缓冲液中电泳。 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。;圆盘电泳;由于蛋白质分子的直径很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动、不能通过半透膜等。 可用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。;蛋白质胶体溶液稳定的因素： 水化膜: 表面分布很多极性基团(?NH2、?COOH、?OH、?SH、?CO?NH?等) ，亲水性强，易吸附水，形成水化膜，使蛋白溶于水，又可隔离蛋白，使其不易沉淀； 颗粒表面电荷: 非等电状态时，都带有相同的净电荷，互相排斥而不易沉淀，并与周围的反离子构成稳定的双电层； 质点大小在1-100nm，可以进行布郎运动。;+; 蛋白质在溶液中靠水化膜和双电层保持其稳定性，水化膜和双电层一旦除去，蛋白质胶体溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中絮结沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。; 在温和条件下，改变溶液的pH或电荷状况或除去水化层，蛋白质将从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，又可重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。;等电点沉淀法：破坏表面电荷的排斥作用。 盐析法：高浓度中性盐如Na2SO4等，破坏水化膜。 有机溶剂沉淀法：丙酮、乙醇等，破坏水化膜。; 在强烈沉淀条件下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性及蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，又称为变性沉淀。;加热沉淀：热变性使蛋白质结构解体而破坏水化层。 强酸碱沉淀：破坏氢键。 重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Ag+. Pb+等）结成不溶性盐而沉淀。 生物碱试剂及某些酸类沉淀法： 当pH＜pI时带正电荷，与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 如单宁酸、苦味酸、钨酸、磺基水杨酸等。;四、蛋白质的分离、纯化与鉴定;纯化的一般程序： 前处理、粗分级、细分级、结晶;? 选含“目的”蛋白多的原料; ? 选来源广、容易得到的原料; ? 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）获得大量稀有蛋白质。; 电泳; 破碎组织和细胞，将蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。; 当获得蛋白质混合物的提取液后，选用一套适当的分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开来。 ;即样品的进一步纯化。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。;4、结晶（Crystal）;（二）蛋白质分离纯化的主要方法;1、根据分子大小差异分离;*透析（dialysis）：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使它与其它小分子化合物如无机盐、单糖、氨基酸以及表面活性剂等分离。;磁力搅拌器;*密度梯度（区带）离心 ：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。;*凝胶过滤（Gel filtration）：又称分子排阻或分子筛层析，即以具有分子筛效应的惰性颗粒状多孔网状物质为支持物，根据分子大小的不同分离物质的技术。;凝胶过滤; Gel filtration chromatography;;柱床体积： Vt=Vo+Vi+Vm（凝胶基质体积） 洗脱体积Ve（自加样到该组分洗脱峰出现时所流出的体积）： Ve=Vo+kd·Vi ;? 几个重要参数: 凝胶床总体积: Vt 凝胶自身的体积: Vm 颗粒内部的水体积(内水体积): Vi 颗粒外的水体积(外水体积): V0 四者关系: Vt =Vg+Vi+V0; 某蛋白质的洗脱体积: Ve 当某蛋白质完全不进入颗粒内部时: Ve=Vo 当某蛋白质进入颗粒内部全部孔径时: